专利名称：兔粘液瘤病毒pcr检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及兔粘液瘤病毒诊断和检测技术领域，更具体的说，涉及一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒及检测方法。该方法灵敏、特异、快速检测。
背景技术：
兔粘液瘤病毒(Myxomavirus)，属于痘病毒科(Poxviridae)、兔痘病毒属 (Leporipox virus)的成员。病毒粒子呈砖形，大小约为280 230nmX 75nm，由兔粘液瘤病毒可引起兔的一种高度接触性、致死性传染病。该病以全身皮下特别是颜面部和天然孔周围皮下发生粘液瘤性肿胀为主要特征。本病最早于1898年在乌拉圭的蒙得维亚发现，随后不久该病即传播到南美的巴西、阿根廷、哥伦比亚和巴拿马等国家。1930年，此病经墨西哥传入美国加利福尼亚洲，目前在美国西部各州呈地方性流行。澳大利亚为消灭野兔所造成的危害，1950年人为地将粘液瘤病毒引入。1952年本病传入欧洲，18个月内传遍了法国、 比利时、德国和荷兰等国，并越过英吉利海峡传到英伦三岛，同时斯堪的纳维亚和北非国家也发生流行。到目前为止，已有至少56个国家和地区发生过本病。我国目前尚未发现本病， 但近几年实验研究证明，中国家兔对兔粘液瘤病毒的发病率和死亡率均为100%，世界动物卫生组织和我国分别将之列为法定报告的疫病或二类动物传染疫病。兔是本病的唯一易感动物，人和其他动物不易感；各种年龄的兔均易感，但幼兔似乎比成年兔更有抵抗力。本病呈季节性发生，夏秋季为发病高峰季节，每8 10年流行一次，主要流行于大洋洲、美洲、欧洲诸国，在我国尚未见报道。本病主要是机械性传播，即经吸血节肢动物包括各种蚊子、跳蚤、蚋蝇、蜱、兔蚤和螨等的口器携带病毒而传播。兔接触或与被污染的饲料、饮水和器具等接触能引起感染，但接触传播不是主要的传播方式。蚊子是本病的主要传播媒介，但在不同地区传播媒介略有差异。根据临床特征、病理变化，结合流行病学可做出初步诊断。确诊需进行实验室检验。取病变组织作切片或涂片检查星状细胞和包涵体，或取新鲜病料接种家兔、鸡胚、兔肾原代细胞或RK13传代细胞分离病毒，用免疫荧光试验、中和试验和琼脂扩散试验进行病毒的鉴定。随着对国外各种种兔及兔产品原料等的引入，该病对我国养兔业的潜在威胁很大，如果传入，所造成的危害和经济损失将无法估量。尤其近年来，非典型性粘液瘤病毒的出现，往往与纤维瘤病毒产生的临床症状相似，对检测技术提出了更高的要求，所以迫切需要解决具有快速、准确的基因诊断技术。目前报道的诊断方法有病理切片、病毒分离、免疫荧光、中和试验等都费时、费力，用于出入境检验检疫不太现实，而且由于进行活毒操作，对实验室生物安全要求极高，采用PCR方法检测标本中的兔粘液瘤病毒的核酸，灵敏度高，快速仅需几小时既可得到结果，特别适合出入境检验检疫检验工作需要。本发明就是在常规 PCR方法的基础上研制的能快速、高灵敏地检测兔粘液瘤病毒的试剂盒及检测方法
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的旨在提供一种兔粘液瘤病毒的PCR检测试剂盒，用于兔粘液瘤病毒的检测和分子流行病学调查。(二)技术方案
兔粘液瘤病毒的M150R基因是一段保守的特异的序列，通过对GenBank发布的兔粘液瘤病毒M150R基因序列的比较，自行设计了一对特异的引物，研制了 PCR检测试剂盒以及提供一种使用该试剂盒快速检测样品中兔粘液瘤病毒的方法，以实现对兔粘液瘤病毒的快速、准确地检测。其中所述兔粘液瘤病毒的PCR检测试剂盒，包括 (I)DNA裂解液
IOOmM 的 Nacl, pH 8. 0 的 IOmM 的 Tris-HCl, pH 8. 0 的 25mM 的 EDTA,按重量体积比含量为1%的SDS和4 μ g/ μ L的蛋白酶K的混合溶液。(2) PCR 反应液
终浓度各50 400 μ M的4中dNTPs,终浓度为0. 1-0. 5 μ M的引物M150R-1和M150R-2， 1.5 — 5. OyM^Mg2+O(3)阳性对照
兔粘液瘤病M150R基因的阳性质粒pTM150R。(4) Taq酶按每个PCR反应含1. OU加入，反应液中不含Taq酶；
此外，本发明的试剂盒里还可以含有3mol/L NaAC、酚、酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇、Taq酶5U/yL、琼脂糖、溴化乙锭和溴酚蓝点样缓冲液。还可以含有PCR反应管。本发明试剂盒的优化反应条件的优化过程 (1)引物浓度优化
将引物浓度选择在0. 1 0. 5 μ M进行PCR扩增试验，结果表明这几个浓度的引物都能扩增出目的条带，并且当每条引物量以20pmol/ μ L，即0. 2 μ M时效果最佳。(2) MgCL2 浓度优化
设置Mg2+浓度范围为1. 5 5. OmM,结果表明此浓度范围内的Mg2+都能扩增出目的条带，并且当Mg2+浓度为2. OmM时，扩增效果最好，不仅无非特异性，而且扩增条带也很明亮清晰。(3) dNIPs浓度的优化
以终浓度为50 400 μ mol/L的4种等浓度的dNIPs进行PCR扩增，结果此浓度范围内的dNIPs均能扩增出目的条带，并且当总dNIPs浓度为200 μ mol/L时为最佳。(4) Taq DNA聚合酶浓度的优化
以终浓度为0. 01 0. IU/ μ L的Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，结果此浓度范围内的 dNTPs均能扩增出目的条带，并且当Taq酶终浓度为0. 05U/ μ L时为最佳。(5)反应程序的确定
对PCR反应的循环数10、20、30以及退火温度50°C 60°C进行PCR扩增，结果循环数在30退火温度为55°C时扩增效果最好。本发明的PCR试剂盒检测兔粘液瘤病毒的方法，步骤如下
1、样品的预处理取检测的样品，加入600μ L灭菌的生理盐水充分洗涤样品得到含有病毒的悬液；
2、样本DNA提取将上述样品反复冻融后，然后加入DNA裂解液，37°C水浴孵育 30min ；孵育好取出加入等体积的平衡酚(pH 8. 0)，上下颠倒混勻，12000rpm离心5min，取上清，如果蛋白含量高，可以再加平衡酚重复抽提一次；上清中加等体积的酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇分别抽提一次，取上清；在上清中加1/10体积的3mol/L NaAC(pH 5. 2)， 2. 5倍体积的冷的无水乙醇，_20°C放置池或过夜；取出后，12000rpm离心15min，弃上清， 75%乙醇洗一次；自然晾干后，将提取物溶解于10 μ L超纯水，作PCR模板备用。3、PCR 扩增
(1)按照扩增数η(η=样品数+2)取PCR反应液，Taq酶混勻于一离心管中，按每管分
装 盖上菅盖备用ο(2)先将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应的反应管中，最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置PCR仪上。(3)PCR 扩增程序95 °C预变性 5 min 后，95 °C变性 1 min，55 °C复性 1 min，72 °C延伸1 min，如此进行30个循环；最后72 °C延伸10 min,同时应设立阳性和阴性对照；
4、PCR扩增产物分析
取5-10μ L扩增后的样品，采用1. 2-1. 5%的琼脂糖凝胶中，120-150V下电泳30-40分钟后在0. 5-1 μ g/mL的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察，如果阳性孔有1000 bpDNA 条带而阴性孔无的情况下，样品孔有IOOObpDNA条带，说明样品中含有兔粘液瘤病毒，反之则没有。(三)有益效果
本发明的积极效果在于试剂盒配制合理、制备简单、PCR反应条件优化、特异性强、敏感性高，结果判断客观准确，对兔粘液瘤病毒核酸有诊断作用。本发明的主要原理为用试剂盒内的DNA裂解液对样品中病毒DNA进行抽提。PCR 试剂管含多聚酶链式反应试剂，通过加入兔粘液瘤病毒特异DNA片段引物和Taq DNA聚合酶等成分，对样品中所提取出的DNA进行特异性的扩增。由于所设计的引物是兔粘液瘤病毒所特有，因此，若样品中含有兔粘液瘤病毒，那么其DNA经过扩增及电泳和溴化乙锭染色后，紫外光检测就可以检测到一定分子量的条带，如果样品中没有兔粘液瘤病毒也就不能出现同样分子量的条带。本发明具有如下优点
本发明在设计兔粘液瘤病毒特异引物并成功建立兔粘液瘤病毒的PCR检测方法的基础上，进一步研制成简单快速敏感的PCR检测试剂盒，与其它的兔粘液瘤病毒检测技术相比，本发明方法的显著的特点是1)检测快速，3-4小时即可得知检测结果，而其它的方法如病毒分离技术至少需要M小时或一个星期以上；特别适合出入境检验检疫检验工作需要；2)检测的灵敏度较高，检测下限低至0. 3pg的DNA浓度；3)本发明根据兔粘液瘤病毒所特有的一段保守序列设计特异引物并进行扩增比较，确保了检测的准确性与特异性。
图1. PCR试剂盒特异性试验，其中1、兔纤维瘤病毒；2、野兔热病原；3、兔出血症病毒；4、兔粘液瘤病毒5、阴性对照； 6、Marker DL2000 ；图2. PCR试剂盒敏感性试验，其中1、Marker DL2000 ；2, 3，4，5，6 分别为 0. Ipg, 0. 3pg. 0. 5pg, 0. 7pg, 0. 9pg ；
图3. PCR试剂盒稳定性试验；其中Γ6分别保存30、60、90、120、150、180天；7、阴性对照；8、Marker DL2000 ；
图4. PCR试剂盒保存条件的试验；其中1、Marker DL2000 ；2、阴性对照；3 6分别保存1个月、3个月、6个月、9个月；
图5. PCR试剂盒检测样品；其中1.标准分子量DL-2000 ；2.兔粘液瘤病毒3. 4. 5，检测样品。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。兔粘液瘤病毒M150R基因阳性克隆的制备
根据GenBank发表的兔粘液瘤病毒M150R基因序列，由大连Takara (宝生物)公司合成并克隆到PMD-T载体中，通过测序证实为兔粘液瘤病毒M150R基因。具体的基因序列 atggcttttg acccgctaca cgagtactgt ctggaggagg aacctataca cgtagatacg
ttgaaggcgt tacaacgtaa cccagaggac gacgtggcca gttgtttgct ggatatttac tttgacgttc tattaatatg gggagtgacg
C 3.3. C 3.3. C 3. 3.
taaacattgt cttactgagc ttaaaaggaa
acctcgccag agacgttaga aacggaacgc gatgcctgtt aaagaacccc gtactagacg tccacttctt gtatatacag atcacgcagc gagtcgaatt acacaagcag aaaggtgcgg acaagtacat
gtataacccc caagatatcg ctctctatac gtcgaacggt
gcttaacgtt catagataac tataacgtgc ataaatatag tgacaaggcg acgttattac acattcacgt cctcaacaag
aacgccgtct tggaactgtt cctgttcgat gcggatatca acaaggactt aaacgcgatc gacgtaccgt atagattaga ggagcattat acgttcgatt agtgcgccat gtgcgacaga gtcctgtatc
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3. 3. C 3.3. C 3. C
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tcgaacgaat cgatttagat atcatgtacg acggcaaatg cgtctacagc 实施例1试剂盒的组成试剂盒含 DNA 裂解液 15ml，其中含有 NaCl IOOmM, Tris-HCl (pH 8. 0)IOmM, EDTA CpH 8. 0)25mM, SDS l%(w/v)和蛋白酶 K 4 μ g/μ L0 PCR 反应管(5 管)(25 μ L/反应 X 20)，其中 dATP, dTTP, dGTP和 dTCP终浓度为 200 μ Μ，引物M150R-1 和M150R-2 的终浓度为 0. 2 μ Μ,Mg2+ 终浓度为2. OmM。其他试剂3mol/L NaAC 2mL、酚、酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇各10mL、 琼脂糖10g、溴化乙锭( ο μ g/ μ L) 100 μ L和6%溴酚蓝点样缓冲液100 μ L, Taq (5U/ μ L) 10 μ L ； 1支兔粘液瘤病毒M150R基因的阳性质粒20 μ L。
实施例2试剂盒的组成试剂盒含 DNA 裂解液 15ml，其中含有 NaCl IOOmM, Tris-HCl (pH 8. 0)IOmM, EDTA CpH 8. 0)25mM, SDS l%(w/v)和蛋白酶 K 4 μ g/μ L0 PCR 反应管(5 管)(25 μ L/反应 X 20)，其中 dATP, dTTP, dGTP 和 dTCP 终浓度为 50 μ Μ，引物 M150R-1 和 M150R-2 的终浓度为 0. 1 μ Μ, Mg2+ 终浓度为1. 5mM。其他试剂3mol/L NaAC 2mL、酚、酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇各10mL、 琼脂糖10g、溴化乙锭( ο μ g/ μ L) 100 μ L和6%溴酚蓝点样缓冲液100 μ L, Taq (5U/ μ L) 10 μ L ； 1支兔粘液瘤病毒M150R基因的阳性质粒20 μ L。实施例3试剂盒的组成
试剂盒含 DNA 裂解液 15ml，其中含有 NaCl IOOmM, Tris-HCl (pH 8. 0)IOmM, EDTACpH 8. 0)25mM, SDS l%(w/v)和蛋白酶 K 4 μ g/μ L0 PCR 反应管(5 管)(25 μ L/反应 X 20)，其中 dATP, dTTP, dGTP和 dTCP终浓度为 400 μ Μ，引物M150R-1 和M150R-2 的终浓度为 0. 5 μ Μ,Mg2+ 终浓度为5. OmM。其他试剂3mol/L NaAC 2mL、酚、酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇各10mL、 琼脂糖10g、溴化乙锭( ο μ g/ μ L) 100 μ L和6%溴酚蓝点样缓冲液100 μ L, Taq (5U/ μ L) 10 μ L ； 1支兔粘液瘤病毒M150R基因的阳性质粒20 μ L。以下实施例，采用的试剂盒为实施例1-3中任一种。实施例4试剂盒的特异性试验
取兔纤维瘤病毒、野兔热病原、兔出血症病毒等3个对照样本的DNA各1 μ L为模板进行试剂盒的特异性PCR扩增，同时设空白、阴阳性对照。PCR扩增条件95 °C预变性5 min 后，95 °C变性1 min，55 ！复性1 min，72 °C延伸1 min，如此进行30个循环；最后72 V 延伸10 min。扩增产物用1. 0%的琼脂糖进行电泳分析，以确定其特异性。电泳结果显示，兔粘液瘤病毒样本的DNA扩增出IOOObp的特定片段，而作为对照样本的DNA均无此扩增条带出现，见图1。实施例5试剂盒的敏感性试验
将定量后的PTM150R分别进行10倍的梯度进行稀释，用PCR试剂盒进行检测，扩增条件同上，同时设空白对照。扩增产物用1.0%的琼脂糖进行电泳分析，以确定其敏感性。电泳结果显示，检测下限低至0. 3pg的DNA浓度，均能扩增出清晰可辨的条带，见图2。实施例6试剂盒的稳定性试验
除Taq酶，PCR反应液，阳性模板_20°C贮存外，裂解液及其其余试剂均在4°C条件下保存。在贮存时间为30、60、90、120、150、180天时取出，用已知PCR阳性质粒检测试剂盒的稳定性。扩增条件同上，同时设空白对照。扩增产物用1.0%的琼脂糖进行电泳分析，以确定其稳定性。结果表明在30、60、90、120、150、180天各时段分别取出试剂盒，用兔粘液瘤病毒阳性质粒进行PCR扩增，均能扩增出明亮的条带，且无非特异性条带，空白对照均为阴性， 见图3。实施例7试剂盒的保存条件试验
将在室温、4°C和_20°C保存1个月、3个月、6个月、9个月的试剂盒(Taq酶始终是_20°C 保存)对已经阳性质粒进行检测。扩增条件同上，同时设空白对照。扩增产物用1.0%的琼脂糖进行电泳分析，以确定其保存条件。结果表明本试剂盒(除Taq酶外)可以在室温、4°C 和-20°C下至少保存6个月，均能扩增出明亮的条带，且无非特异性条带，空白对照均为阴性。建议试剂盒内Taq酶，PCR反应液，阳性模板_20°C贮存，裂解液及其其余试剂均在4°C 条件下保存，这样检测的效果会更好，见图4。
实施例8
采集了某养殖场兔咽喉拭子和粪便拭子样品，以及兔产品样品共121份，编号，然后放入4°C冰箱待检。1、样品的预处理取检测的样品，加入600 μ L灭菌的生理盐水充分洗涤样品得到含有病毒的悬液；
2、样本DNA提取将上述样品反复冻融后，然后加入DNA裂解液，37°C水浴孵育 30min ；孵育好取出加入等体积的平衡酚(pH 8. 0)，上下颠倒混勻，12000rpm离心5min，取上清，如果蛋白含量高，可以再加平衡酚重复抽提一次；上清中加等体积的酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇分别抽提一次，取上清；在上清中加1/10体积的3mol/L NaAC(pH 5. 2)， 2. 5倍体积的冷的无水乙醇，_20°C放置池或过夜；取出后，12000rpm离心15min，弃上清， 75%乙醇洗一次；自然晾干后，将提取物溶解于10μ L超纯水，作PCR模板备用。3、PCR 扩增
(1)按照扩增数η(η=样品数+2)取PCR反应液，Taq酶混勻于一离心管中，按每管分
装 盖上菅盖备用ο(2)先将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应的反应管中，最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置PCR仪上。(3)PCR 扩增程序95 °C预变性 5 min 后，95 °C变性 1 min，55 °C复性 1 min，72 °C延伸1 min，如此进行30个循环；最后72 °C延伸10 min,同时应设立阳性和阴性对照；
4、PCR扩增产物分析
取5-10μ L扩增后的样品，采用1. 2-1. 5%的琼脂糖凝胶中，120-150V下电泳30-40分钟后在0. 5-1 μ g/mL的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察，结果见图5。从图5可见阳性孔有IOOObpDNA条带，阴性孔无，样品孔未见IOOObpDNA条带，说
明样品中没有兔粘液瘤病毒。检测结果所取样品中未检测出兔粘液瘤病毒。
权利要求
1.一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒，其特征在于它含有(1)、DNA裂解液；(2)、PCR反应液，其含有终浓度各0.1-0. 5μ M的特异性引物M150R-1 5' - atggcttttg acccgctacacgag_3'M150R-2 5' - catttgccgt cgtacatgatatct_3' (3)、兔粘液瘤病M150R基因的阳性质粒pTM150R(4) Taq 酶。
2.根据权利要求1所述的一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，其中的DNA 裂解液为Nacl，Tris-HCl, EDTA, SDS和蛋白酶K的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，其中的DNA 裂解液为IOOmM 的 Nacl, pH 8. 0 的 IOmM 的 Tris-HCl, pH 8. 0 的 25mM 的 EDTA,按重量体积比含量为1%的SDS和4 μ g/ μ L的蛋白酶K的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，其中的PCR 反应液还含有终浓度各50 400 μ M的dATP, dTTP, dGTP和dTCP，1. 5 5. OmM的Mg2+。
5 根据权利要求4所述的一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒，其特征在于其中PCR反应液中dATP, dTTP, dGTP和dTCP终浓度为200 μ M，引物M150R-1和M150R-2的终浓度为 0. 2 μ Μ，Mg2+ 终浓度为 2. OmM0
6.根据权利要求1所述一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒，其特征在于，还含有3mol/ L NaAC、酚、酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇、琼脂糖、溴化乙锭和溴酚蓝点样缓冲液。
7.根据权利要求1所述一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒及，其特征在于所述的Taq 酶为IU。
8.根据权利要求1所述一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒及其应用，其特征在于所述的PCR反应液，其含有终浓度各0. 2 μ M的特异性引物一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤(1)样品的预处理；(2)用权利要求1 7任一所述的试剂盒进行检测，包括a、取预处理的样品，加入DNA裂解液，37°C水浴孵育30min；b、孵育好取出加入等体积的平衡酚(pH8.0)，上下颠倒混勻，12000rpm离心5min，取上清，如果蛋白含量高，可以再加平衡酚重复抽提一次；c、上清中加等体积的酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇分别抽提一次，取上清；d、在上清中加1/10体积的3mol/LNaAC(pH 5. 2),2.5倍体积的冷的无水乙醇，-20°C 放置浊或过夜；e、取出后，12000rpm离心15min，弃上清，75%乙醇洗一次；自然凉干后，将提取物溶解于10 μ L超纯水，作PCR模板备用；(3)PCR扩增在一PCR试剂管内加入0. 5-lyL的DNA提取液、PCR反应液、0. 2-lyL 5U/y L Taq DNA聚合酶，瞬时离心混勻，置PCR仪进行扩增；95 °C预变性5 min后，95 °C变性1 min，55 ！复性1 min，72 °C延伸1 min，如此进行30个循环；最后72 °C延伸10 min，同时应设立阳性和阴性对照；(4) PCR扩增产物分析取5-10 μ L扩增后的样品，采用1. 2-1. 5%的琼脂糖凝胶中，120-150V下电泳30-40分钟后在0. 5-1 μ g/mL的溴化乙锭溶液中染色，在紫外灯下观察，阳性孔有1000 bpDNA条带而阴性孔无的情况下，如果样品孔有1000 bpDNA条带，则样品中含有兔粘液瘤病毒，反之则没有。
全文摘要
本发明提供了一种兔粘液瘤病毒PCR检测试剂盒，用于兔粘液瘤病毒的诊断和检测。该试剂盒是根据兔粘液瘤病毒M150R基因序列设计特异性引物、建立了PCR检测方法、优化了PCR反应条件而研制出来的，本发明还提供了使用该试剂盒的检测兔粘液瘤病毒的方法。本发明的PCR检测试剂盒可以快速准确地检测兔粘液瘤病毒。
文档编号C12Q1/68GK102230035SQ20111018830
公开日2011年11月2日 申请日期2011年7月6日 优先权日2011年7月6日
发明者唐泰山, 姜焱, 张常印, 张扬, 张敬友, 张睿, 王凯民, 陈国强 申请人:中华人民共和国江苏出入境检验检疫局