专利名称：利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤检测试剂盒开发领域，更具体地说，涉及一种利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法。
背景技术：
原癌基因C-myc是一种使细胞无限增殖、获永生化功能、促进细胞分裂的可调节基因，在很多肿瘤中都高表达[1]。在癌变细胞中，C-myc蛋白表达异常增高，使细胞脱离正常生长的调节限制，向恶性表型转化，发生癌变。据报道，C-myc基因的过表达与肿瘤发生发展密切相关，如白血病，肺癌，肝癌，胃癌，乳腺癌，结肠癌，宫颈癌，某些神经母细胞病，视网膜母细胞瘤，成骨肉瘤，软骨肉瘤，脊索瘤，脂肪肉瘤，横纹肌肉瘤，何杰金氏病及头部肿瘤等都有C-myc基因的扩增或过度表达[2]。特别是在所有的B淋巴细胞性白血病组织中C-myc基因过表达[3]。与正常细胞相比，肿瘤细胞中C-myc的表达量增高几十倍，是恶性肿瘤发生的一个重要标志。目前，有关C-Myc研究的文章及专利如下(I)Dang CV, Resar LM, Emi son E, et al. Function of the C-myconcogenictranscription factor[J]. Exp Cell Res, 1999, 253(1):63-77.(2) Riou GF, Bourhis J, Le MG. The C-myc proto-oncogene in invasivecarcinomasof the uterine cervix:clinical relevance of over expression in earlystages of thecancer[J]. Anticancer Res, 1990, 9-10(5A):1225-1231.(3) May PC, Foot N, Dunn R, et al. Detection of cryptic and variantIgH-MYCrearrangements in high-grade non-Hodgkin's lymphoma by fluorescencein situhybridization:1mplications for cytogenetic testing[J]. Cancer GenetCytogenet, 2010, 198(1) : 71-75.(4)用于检测致癌基因C-myc重组蛋白的LSPR传感芯片(专利公开号CN102175649A)(5)—种致癌基因C-myc蛋白的荧光光谱测定方法(专利公开号CN101893573A)文章1-3主要研究关于C-Myc在肿瘤组织中的高表达的意义以及其机理。专利4发明提供了一种基于局域表面等离子体共振(LSPR)光谱检测致癌基因C-myc重组蛋白的LSPR传感芯片。在LSPR传感芯片的金膜表面组装上一层DTT单分子层，接上金纳米粒子层，在所述金纳米粒子层表面修饰上3-巯基丙酸单分子层，然后通过DMAP-EDC活化,使3-巯基丙酸单分子层与C-myc单克隆抗体结合,通过C_myc单克隆抗体与C-myc重组蛋白的免疫反应结合，引起金纳米粒子表面产生局域表面等离子体共振吸收峰的位移，以此来检测癌变组织中C-myc重组蛋白的含量。专利5发明公开了一种致癌基因C-myc蛋白的荧光光谱测定方法，其测定依据是C-myc蛋白本身具有荧光性并且与金纳米溶胶结合后发生荧光猝灭现象，该荧光猝灭强度(AF)与C-myc蛋白浓度变化之间呈线性对应关系,达到测定C_myc蛋白含量的目的。
目前,利用两种单克隆抗体快速检测c-Myc的ELISA尚无报道。
发明内容
本发明开发一种利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA，旨在获得稳定分泌特异性和敏感性很高的抗C-myc IgG1单克隆抗体和IgM单克隆抗体，为多种肿瘤特别是B淋巴细胞性白血病诊断试剂盒的开发提供坚实的数据基础。为了达到上述目的，本发明一种利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，包括如下步骤S1、制备C-myc抗原,并纯化,获得纯化的C_myc蛋白；S2、利用所述纯化的C-myc蛋白进行免疫健康Balb/c小鼠；S3、将免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合；S4、筛选阳性杂交瘤细胞；S5、对所述阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，获得2株能够稳定分泌抗C-myc IgG1的克隆及抗C-myc IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株；S6、Balb/c小鼠腹腔内注射两种所述单克隆抗体杂交瘤细胞株，大量制备单克隆抗体；S7、选用以下三种方法中的任意一种，实现快速检测C-Myc 方法1:利用两种抗c-Myc单克隆抗体检测肿瘤细胞c_Myc表达量的夹心法ELISA法。方法2 :利用抗c-Myc IgM单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法。方法3:利用抗c-Myc IgG单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法。优选方式下，步骤SI的具体分步为S11、将含有原核表达载体的pET20b-C-myc表达菌E. coli BL21在37°C震荡培养，170rpm ；S12、经IPTG诱导后，收集菌体，超声波打碎、利用镍柱子层析纯化。具体说，步骤SI的具体方法为将含有原核表达载体pET20b-C-myc表达菌的E.coli BL21 在 37°C震荡培养，170rpm;菌液 OD6tltol 值为 0.4-0.6时，经1-2禮 IPTG 诱导1-3小时后，6500rmp离心IOmin收集细胞，悬浮，破碎超声破碎仪破碎细胞10min，2_8M尿素进行变性2h后再复性，经AKATA仪用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后得到90-95%以上纯度的C-Myc蛋白。优选方式下，上述步骤S2具体步骤为利用原核表达并纯化的C-myc蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔内，0. 4ml/只，抗原量为50-lOOy g/只；首次免疫14天后，改用弗氏不完全佐剂与同体积的抗原量充分乳化进行第
2次免疫，抗原量不变；第28天，按照100-200 u g/只抗原量对小鼠进行第三次免疫，小鼠的抗体效价达到了1:64000-1 1280000。优选方式下，上述步骤S3具体步骤为Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1-10:1的比例混合于50ml离心管中，1200rpm、5min离心，弃上清,在25s_30s内迅速滴A 37°C预热的50%的PEG1000约0. 5ml并轻轻混匀，700rpm、2min离心，再沿管壁缓慢加入37°C预热的RPM1-1640基础培养基15ml，使试管做划圆样运动约2min，离心1400rpm、5min，弃上清，同法再清洗I次。沿管壁缓慢加入37°C预热的HT培养基30ml，轻轻混匀融合细胞。优选方式下，上述步骤S5具体步骤为当杂交瘤细胞集落生长40-60%以上时，用ELISA方法筛选阳性孔；针对阳性孔，用HT培养基稀释细胞，进行亚克隆。培养第8-9天，对标记的单克隆细胞孔的上清进行ELISA检测，筛选阳性克隆。优选方式下，上述步骤S6具体步骤为向健康雌性Balb/c小鼠腹腔内注射高压灭菌后的液体石腊油，0. 4-0. 6ml/只。一周后,再向其腹腔注射能稳定分泌C-myc抗体的杂交瘤细胞，0. 5ml/只，细胞数约为2-5X IO6个；10-14天后，待小鼠腹部明显膨大并行动迟缓时，收集腹水，3000rpm、IOmin离心，弃去脂肪和石蜡油，收集中层澄清腹水，_20°C冻存备用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效价分别为1:64000、1:32000。优选方式下，上述步骤S7中方法I的具体步骤为用pH 9. 6的碳酸盐缓冲液稀释包被抗C-myc IgM的单克隆抗体 杂交瘤细胞株，使浓度达到5_20 y g/ml ;用PBS-T洗涤，200 iil/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次；加入1:10-1 :50倍稀释的被检肿瘤细胞裂解液，37°C反应Ih ;用PBS-T洗涤；加入封闭液200 U I/孔，37°C湿盒温浴Ih ;加入I 1000-1 2000倍比稀释的抗C-myc IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株，100 U I/孔，37°C湿盒温浴Ih ;用PBS-T洗涤；将HRP酶标羊抗小鼠IgG做1:5000稀释，100 U I/孔加入酶标板，37°C湿盒温浴Ih ;用PBS-T洗涤；加入邻苯二胺液100 iil/孔，37°C避光反应15min ;加入终止液，2mol/L硫酸溶液，100 u I/孔，酶标仪测定OD492nm值。优选方式下，上述步骤S7中方法2的具体步骤为用pH 9. 6的碳酸盐缓冲液稀释包被1:10-1 50倍稀释的被检肿瘤细胞裂解液。用PBS-T洗涤，200 u I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次；加入封闭液200 u I/孔，37°C温浴Ih ;加入I =1000-1 2000倍比稀释的抗C-Myc IgM (2A9) 100 U I/孔，37°C温浴Ih ;用PBS-T洗涤；将HRP酶标羊抗小鼠IgM做1:5000-1:10000稀释，100 u I/孔加入酶标板，37°C温浴Ih ;用PBS-T洗涤；加入邻苯二胺(OPD)液IOOu I/孔，37°C避光反应15min ;加入终止液(2mol/L硫酸溶液)100 U I/孔，酶标仪测定 0^49211111 值。优选方式下，上述步骤S7中方法3的具体步骤为用pH 9. 6的碳酸盐缓冲液稀释包被1:10-1 50倍稀释的被检肿瘤细胞裂解液。37°C反应Ih ;用PBS-T洗涤；加入封闭液200iil/孔，37°C 温浴 Ih ;加入1:1000-1 :2000 倍比稀释的抗 c_Myc IgG(2B2)100 iil/孔，37°C温浴Ih ;用PBS-T洗涤；将HRP酶标羊抗小鼠IgG做1:5000稀释，100 U I/孔加入酶标板，37°C温浴Ih ;用PBS-T洗涤;加入邻苯二胺(OPD)液IOOiU/孔，37°C避光反应15min ；加入终止液(2mol/L硫酸溶液)100 u I/孔，酶标仪测定OD492nm值。本发明利用单克隆抗体快速检测C-Myc的夹心法ELISA,首先通过蛋白纯化技术将原核表达C-Myc蛋白提纯。利用纯化C-myc进行免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法筛选，亚克隆及单克隆抗体Ig亚型鉴定，获得2株能够稳定分泌抗C-myc IgG1的克隆(2B2)及抗C-myc IgM (2A9)克隆。利用抗C-myc IgG1抗体以及抗C-myc IgM抗体,建立快速检测c_Myc的夹心法ELISA。应用本发明对C_myc蛋白样品进行准确测定,可检测的C-myc蛋白浓度范围为0. 01 1000pmol/L,检出下限为0. 01 0. 05pmol/L。本发明大大提高了检测C-Myc的特异性和敏感性，操作简单、重复性高，本发明检测肿瘤组织中的C-Myc的表达量，为恶性肿瘤的筛选提供实验数据。本发明可将利用单克隆抗体快速检测C-Myc的夹心法ELISA开发成具有自主知识产权的新型检测肿瘤试剂盒并推向产业化，造福全人类，具有极大的社会意义和广泛的市场意义。
图1是C-myc蛋白纯化图；其中，泳道I为蛋白质marker ;泳道2为菌体裂解液上清；泳道3为菌体裂解液包涵体；纯化的C-myc蛋白；图2是小鼠3次免疫后血清中的抗体效价；图3是融合第9天的杂交瘤细胞株(200倍)；图4是单克隆抗体的亚型鉴定； 图5是测定健康组织和肿瘤组织中c-Myc含量的比较。
具体实施例方式本发明的技术方案是本发明首先原核表达c-Myc蛋白，再通过蛋白纯化技术将C-Myc蛋白提取、纯化。利用纯化C-myc进行免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法筛选，亚克隆及单克隆抗体Ig亚型鉴定，获得2株能够稳定分泌抗C-myc IgG1的克隆(2B2)及抗C-myc IgM (2A9)克隆。利用抗C-myc IgG1单克隆抗体以及抗C-myc IgM单克隆抗体,建立快速检测c_Myc的夹心法ELISA。实施例1 :具体方法步骤如下1. C-myc抗原的制备与纯化菌液OD6tltol值为0. 4时，经IPTG诱导I小时后，6500rmp离心IOmin收集细胞，悬浮，超声破碎仪破碎细胞(20%功率，破碎IOmin)，2-8M尿素进行变性2h后再复性，经AKATA仪用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后得到95%以上纯度的c-Myc蛋白(图1)。2.单克隆抗体的制备2.1动物免疫利用原核表达并纯化的C-myc蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔内，0. 4ml/只，抗原量为50 u g/只；首次免疫14天后，改用弗氏不完全佐剂与同体积的抗原量充分乳化进行第2次免疫，抗原量不变;第28天，按照IOOyg/只抗原量对小鼠进行加强免疫。第三次免疫后，小鼠的抗体效价达到了 1:640000，见图2，结果说明所建立的免疫程序合理有效。2. 2细胞融合收集免疫Balb/c小鼠脾细胞后与SP2/0骨髓瘤细胞以10:1的比例混合于50ml离心管中，1200rpm、5min离心，弃上清，在25s时迅速滴入37°C预热的50%的PEG1000约0. 5ml并轻轻混匀，700rpm、2min离心，再沿管壁缓慢加入37°C预热的RPM1-1640基础培养基15ml,使试管做划圆样运动约2min, 1400rpm、5min离心,弃上清，同法再清洗I次。沿管壁缓慢加入37°C预热的HT培养基30ml，轻轻混匀融合细胞，滴加到预先铺有滋养层细胞的96孔板中，100 u I/孔，置于37°C、5%C02培养箱培养。次日补加HAT培养基[含有次黄嘌呤01)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培养基]50 ill/孔；第4天，每孔吸弃200111，再加入HAT培养基100 u I/孔；第7天，每孔再补加100 U I HAT培养基。融合后第9天，镜下会观察到未融合或自身融合的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞会全部死亡，而杂交瘤细胞存活(图3)。2. 3阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆当杂交瘤细胞集落生长50%以上时，用ELISA方法筛选阳性孔。针对阳性孔，用HT培养基[含有次黄嘌呤01)、胸苷(T)的培养基]稀释细胞，滴加到另一已铺有滋养细胞的96孔板内，进行亚克隆。亚克隆第5天，标记有单克隆细胞的孔并半量更换HT培养基。第9天，对标记的单克隆细胞孔的上清进行ELISA检测，获得2株能稳定分泌抗C-myc的单克隆抗体杂交瘤细胞株，2B2及2A9克隆。经用Sigma 的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 检测，显不出2B2及2A9克隆的抗体类型分别为IgG1亚类和IgM (图4)。2. 4单克隆抗体的大量制备在健康雌性Balb/c小鼠腹腔内注射高压灭菌后的液体石蜡油，0. 4ml/只。一周后，再向其腹腔注射能稳定分泌C-myc抗体的杂交瘤细胞，0. 5ml/只(细胞数约为2X IO6个)。10-14天后，待小鼠腹部明显膨大并行动迟缓时，收集腹水，3000rpm、IOmin离心，弃去脂肪和石蜡油，收集中层澄清腹水，_20°C冻存备用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效价分别为1:64000、1:32000，表明获得的单克隆抗体具有较高的敏感性。3利用两种抗c-Myc单克隆抗体检测肿瘤细胞c_Myc表达量的夹心法ELISA法3.1 包被包被抗c-Myc IgM (2A9),使浓度达到5 U g/ml,每孔50 ii I包被酶标板,37°C反应l-2h。3. 2 洗板甩干包被液，用PBST洗涤，200iil/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 3 封闭加入封闭液200 U I/孔，37°C湿盒温浴30min。3. 4 洗板用PBST洗涤，200 U I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 5加入被检肿瘤细胞Raji细胞裂解物加入1:10倍稀释的被检肿瘤细胞裂解液。37°C反应lh。阴性对照为正常细胞裂解液；阳性对照为Raji细胞裂解液。3. 6 洗板用PBST洗涤，200 U I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 7 一抗反应加入I 1000倍比稀释的抗C-myc IgM (2B2) 100 U I/孔，37°C湿盒温浴lh。3. 8 洗板甩干一抗，用PBST洗涤，200 U I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 9 二抗反应将HRP酶标羊抗小鼠IgG做1:5000稀释，100 U I/孔加入酶标板，37°C湿盒温浴Ih0
3. 10 洗板甩干二抗，用PBST洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 11 底物加入邻苯二胺(OPD)液100 μ I/孔，37°C避光反应15min。3. 12 终止加入终止液(2mol/L硫酸溶液)100 μ I/孔，酶标仪测定OD492nm值。本实验制备B淋巴细胞白血病细胞裂解液，进行夹心法ELISA实验，测定健康组织和肿瘤组织中c-Myc含量。实验结果用均数土准差表示表示与未免疫组比较Ρ〈0. 01,结果见图5。由图5中可见，肿瘤组织中c-Myc含量明显高于健康组织，且差异具有统计学意义(Ρ〈0. 01)。本实验使用抗C-Myc IgM (2Α9)和抗c_Myc IgGl (2B2)单克隆抗体快速检测肿瘤细胞中的c-Myc抗原，具有高度特异性和敏感性，所需时间为4. 5-6h，阳性检测率达到100%ο可检测的c-Myc蛋白浓度范围为O. 01 IOOOpmo 1/L，检出下限为O. 01 O. 05pmo1/L。实施例2 具体方法步骤如下l.C-myc抗原的制备与纯化菌液OD6tltol 值为O. 6时，经IPTG诱导I小时后，6500rmp离心IOmin收集细胞，悬浮，超声破碎仪破碎细胞(20%功率，破碎IOmin)，2-8M尿素进行变性2h后再复性，经AKATA仪用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后得到95%以上纯度的c-Myc蛋白(图1)。2.单克隆抗体的制备2.1动物免疫利用原核表达并纯化的C-myc蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔内，O. 6ml/只，抗原量为100 μ g/只；首次免疫14天后，改用弗氏不完全佐剂与同体积的抗原量充分乳化进行第2次免疫，抗原量不变;第28天，按照200 μ g/只抗原量对小鼠进行加强免疫。第三次免疫后，小鼠的抗体效价达到了1:1280000，见图2，结果说明所建立的免疫程序合理有效。2. 2细胞融合收集免疫Balb/c小鼠脾细胞后与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1的比例混合于50ml离心管中，1200rpm、5min离心，弃上清，在30s时迅速滴入37°C预热的50%的PEG1000约O. 5ml并轻轻混匀，700rpm、2min离心，再沿管壁缓慢加入37°C预热的RPM1-1640基础培养基15ml,使试管做划圆样运动约2min, 1400rpm、5min离心,弃上清，同法再清洗I次。沿管壁缓慢加入37°C预热的HT培养基30ml，轻轻混匀融合细胞，滴加到预先铺有滋养层细胞的96孔板中，10(^1/孔，置于371、5%0)2培养箱培养。次日补加HAT培养基50 μ I/孔；第4天，每孔吸弃200 μ 1，再加入HAT培养基100 μ I/孔；第7天，每孔再补加100 μ I HAT培养基。融合后第9天，镜下会观察到未融合或自身融合的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞会全部死亡，而杂交瘤细胞存活(图3)。2. 3阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆当杂交瘤细胞集落生长50%以上时，用ELISA方法筛选阳性孔。针对阳性孔，用HT培养基稀释细胞，滴加到另一已铺有滋养细胞的96孔板内，进行亚克隆。亚克隆第5天，标记有单克隆细胞的孔并半量更换HT培养基。第9天，对标记的单克隆细胞孔的上清进行ELISA检测，获得2株能稳定分泌抗C-myc的单克隆抗体杂交瘤细胞株，2B2及2A9克隆。经用Sigma 的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 检测，显不出2B2及2A9克隆的抗体类型分别为IgG1亚类和IgM (图4)。2. 4单克隆抗体的大量制备在健康雌性Balb/c小鼠腹腔内注射高压灭菌后的液体石蜡油，O. 6ml/只。一周后，再向其腹腔注射能稳定分泌C-myc抗体的杂交瘤细胞，O. 5ml/只(细胞数约为5X IO6个)。10-14天后，待小鼠腹部明显膨大并行动迟缓时，收集腹水，3000rpm、IOmin离心，弃去脂肪和石蜡油，收集中层澄清腹水，_20°C冻存备用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效价分别为1:64000、1:32000，表明获得的单克隆抗体具有较高的敏感性3利用抗c-Myc IgM单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法3.1 包被包被0. 01 IOOOpmo 1/L的被检肿瘤细胞裂解液。37°C反应lh。阴性对照为正常细胞裂解液；阳性对照为Raji细胞裂解液。3. 2 洗板甩干包被液，用PBST洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 3 封闭加入封闭液200 μ I/孔，37°C湿盒温浴30min。3. 4 洗板用PBST洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 5 —抗反应加入I 2000 倍稀释的抗 C-Myc IgM (2A9) 100 μ I/ 孔，37°C温浴 lh。3. 6 洗板甩干一抗，用PBST洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 7 二抗反应将HRP酶标羊抗鼠IgM做1:5000稀释，100 μ I/孔加入酶标板，37°C湿盒温浴lh。3. 8 洗板甩干二抗，用PBST洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 9 底物加入底物液100μ I/孔，37°C避光反应15min。
3. 10 终止加入终止液100 μ I/孔，酶标仪测定OD492nm值。本实验使用抗C-Myc IgM (2Α9)单克隆抗体快速检测肿瘤细胞中的c_Myc抗原，具有高度特异性和敏感性，所需时间为2. 5-3h，阳性检测率达到100%。可检测的c-Myc蛋白浓度范围为0. 01 IOOOpmo 1/L，检出下限为0. 01 0. 05pmol/L。实施例3:具体方法步骤如下1. C-myc抗原的制备与纯化
菌液OD6tltol值为O. 6时，经IPTG诱导I小时后，6500rmp离心IOmin收集细胞，悬浮，超声破碎仪破碎细胞(20%功率，破碎IOmin)，2-8M尿素进行变性2h后再复性，经AKATA仪用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后得到95%以上纯度的c-Myc蛋白(图1)。2.单克隆抗体的制备2.1动物免疫利用原核表达并纯化的C-myc蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔内，O. 6ml/只，抗原量为100 μ g/只；首次免疫14天后，改用弗氏不完全佐剂与同体积的抗原量充分乳化进行第2次免疫，抗原量不变；第28天，按照200 μ g/只抗原量对小鼠进行加强免疫。第三次免疫后，小鼠的抗体效价达到了1:1280000，见图2，结果说明所建立的免疫程序合理有效。2. 2细胞融合收集免疫Balb/c小鼠脾细胞后与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1的比例混合于50ml离心管中，1200rpm、5min离心，弃上清，在30s时迅速滴入37°C预热的50%的PEG1000约O. 5ml并轻轻混匀，700rpm、2min离心，再沿管壁缓慢加入37°C预热的RPM1-1640基础培养基15ml,使试管做划圆样运动约2min, 1400rpm、5min离心,弃上清，同法再清洗I次。沿管壁缓慢加入37°C预热的HT培养基30ml，轻轻混匀融合细胞，滴加到预先铺有滋养层细胞的96孔板中，10(^1/孔，置于371、5%0)2培养箱培养。次日补加HAT培养基50 μ I/孔；第4天，每孔吸弃200 μ 1，再加入HAT培养基100 μ I/孔 ’第7天，每孔再补加100 μ I HAT培养基。融合后第9天，镜下会观察到未融合或自身融合的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞会全部死亡，而杂交瘤细胞存活(图3)。2. 3阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆
当杂交瘤细胞集落生长50%以上时，用ELISA方法筛选阳性孔。针对阳性孔，用HT培养基稀释细胞，滴加到另一已铺有滋养细胞的96孔板内，进行亚克隆。亚克隆第5天，标记有单克隆细胞的孔并半量更换HT培养基。第9天，对标记的单克隆细胞孔的上清进行ELISA检测，获得2株能稳定分泌抗C-myc的单克隆抗体杂交瘤细胞株，2B2及2A9克隆。经用Sigma 的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents 检测，显不出2B2及2A9克隆的抗体类型分别为IgG1亚类和IgM (图4)。2. 4单克隆抗体的大量制备在健康雌性Balb/c小鼠腹腔内注射高压灭菌后的液体石蜡油，0. 6ml/只。一周后，再向其腹腔注射能稳定分泌C-myc抗体的杂交瘤细胞，0. 5ml/只(细胞数约为5X IO6个)。10-14天后，待小鼠腹部明显膨大并行动迟缓时，收集腹水，3000rpm、IOmin离心，弃去脂肪和石蜡油，收集中层澄清腹水，_20°C冻存备用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效价分别为1:64000、1:32000，表明获得的单克隆抗体具有较高的敏感性3利用抗c-Myc IgG单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法3.1 包被包被0. 01 IOOOpmo 1/L的被检肿瘤细胞裂解液。37°C反应lh。阴性对照为正常细胞裂解液；阳性对照为Raj i细胞裂解液。3. 2 洗板用PBST洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。
3. 3 封闭加入封闭液200 μ I/孔，37°C湿盒温浴30min。3. 4 洗板用PBST洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 5 —抗反应加入I 2000 倍稀释的抗 c-Myc IgG (2B2) 100 μ I/ 孔，37°C湿盒温浴 lh。3. 6 洗板甩干一抗，用PBST洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 7 二抗反应将HRP酶标羊抗鼠IgG做1:5000稀释，100 μ I/孔加入酶标板，37°C湿盒温浴lh。3. 8 洗板甩干二抗，用PBST洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次。3. 9 底物加入底物 液100 μ I/孔，37°C避光反应15min。3. 10 终止加入终止液100 μ I/孔，酶标仪测定OD492nm值。本实验使用抗c-Myc IgG (2Β2)单克隆抗体快速检测肿瘤细胞中的c_Myc抗原，具有高度特异性和敏感性，所需时间为2. 5-3h，阳性检测率达到100%。可检测的c-Myc蛋白浓度范围为O. 01 1000pmol/L，检出下限为O. 01 O. 05pmol/L。根据上述三个实施例，本发明利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，可概括为如下步骤S1、C-myc抗原的制备与纯化，具体分步如下S11、将含有原核表达载体(pET20b-C_myc表达菌)的表达菌E. coli BL21在37°C震荡培养(170rpm)；S12、经IPTG诱导后，收集菌体，超声波打碎、利用镍柱子层析纯化；S2、制备抗C-myc单克隆抗体,具体分步如下S21、将利用纯化的C-myc蛋白进行免疫健康Balb/c小鼠；S22、将免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合；S23、第3-4天，利用HAT培养基进行筛选。S24、对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，获得2株能稳定分泌抗C-myc的单克隆抗体杂交瘤细胞株，2B2及2A9克隆。S25、2B2及2A9克隆的抗体亚型分别为IgG1亚类和IgM。S26、Balb/c小鼠腹腔内注射2B2及2A9克隆细胞株，大量制备单克隆抗体。S27、选用以下三种方法中的任意一种，实现快速检测C-Myc 方法1:利用两种抗c-Myc单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的夹心法ELISA法。方法2:利用抗c-Myc IgM单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法。方法3:利用抗c-Myc IgG单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法。优选方式下，步骤SI的具体步骤为将含有原核表达载体(pET20b-C-myc表达菌)的E. coli BL21在37°C震荡培养(170rpm)，菌液 OD6ticinm 值为 O. 4-0. 6 时，经 l_2mM IPTG 诱导 1-3 小时后，6500rmp 离心 IOmin收集细胞，悬浮，超声破碎仪破碎细胞(20%功率，破碎10min)，2-8M尿素进行变性2h后再复性，经AKATA仪用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后得到90-95%以上纯度的C-Myc蛋白。优选方式下，步骤S21具体步骤为利用原核表达并纯化的C-myc蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔内，O. 4ml/只，抗原量为50-100 μ g/只；首次免疫14天后，改用弗氏不完全佐剂与同体积的抗原量充分乳化进行第2次免疫，抗原量不变；第28天，按照100-200 μ g/只抗原量对小鼠进行第三次免疫，小鼠的抗体效价达到了1:64000-1:1280000。优选方式下，在步 骤S22具体步骤为Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1-10:1的比例混合于50ml离心管中，1200rpm、5min离心,弃上清,在25s_30s内迅速滴入37°C预热的50%的PEG1000约O. 5ml并轻轻混匀，700rpm、2min离心，再沿管壁缓慢加入37°C预热的RPM1-1640基础培养基15ml，使试管做划圆样运动约2min，离心1400rpm、5min，弃上清，同法再清洗I次。沿管壁缓慢加入37°C预热的HT培养基30ml，轻轻混匀融合细胞。优选方式下，在步骤S24具体步骤为当杂交瘤细胞集落生长40-60%以上时，用ELISA方法筛选阳性孔。针对阳性孔，用HT培养基稀释细胞，进行亚克隆。培养第8-9天，对标记的单克隆细胞孔的上清进行ELISA检测，筛选阳性克隆。优选方式下，在步骤S26具体步骤为向健康雌性Balb/c小鼠腹腔内注射高压灭菌后的液体石腊油，O. 4-0. 6ml/只。一周后,再向其腹腔注射能稳定分泌C-myc抗体的杂交瘤细胞，O. 5ml/只(细胞数约为2-5X106个)。10-14天后，待小鼠腹部明显膨大并行动迟缓时，收集腹水，3000rpm、IOmin离心，弃去脂肪和石蜡油，收集中层澄清腹水，_20°C冻存备用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效价分别为1:64000、1:32000。优选方式下，在步骤S27中方法I的具体步骤为用pH 9. 6的碳酸盐缓冲液稀释包被抗C-myc IgM (2A9)，使浓度达到5-20 μ g/ml ;用PBS-T洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次；加入1:10-1 50倍稀释的被检肿瘤细胞裂解液。37°C反应Ih ;用PBS-T洗涤；加入封闭液200 μ I/孔，37°C湿盒温浴Ih ;加入1:1000-1 :2000倍比稀释的抗C-myc IgM(2B2)100 μ I/孔，37°C湿盒温浴Ih ;用PBS-T洗涤；将HRP酶标羊抗小鼠IgG做1:5000稀释，100 μ I/孔加入酶标板，37°C湿盒温浴Ih ;用PBS-T洗涤；加入邻苯二胺(OPD)液100μ I/孔，37°C避光反应15min ;加入终止液(2mol/L硫酸溶液)100 μ I/孔，酶标仪测定 OD492nm 值。优选方式下，在步骤S27中方法2的具体步骤为用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释包被1:10_1 50倍稀释的被检肿瘤细胞裂解液。用PBS-T洗涤，200 μ I/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次；加入封闭液200 μ I/孔，37°C温浴 Ih ;加入1:1000-1 :2000 倍比稀释的抗 C-Myc IgM (2A9) 100 μ I/孔，37°C温浴 Ih ；用I3BS-T洗涤；将HRP酶标羊抗小鼠IgM做1: 5000-1:10000稀释，100 μ I/孔加入酶标板，37°C温浴Ih ;用PBS-T洗涤；加入邻苯二胺(OPD)液100 μ I/孔，37°C避光反应15min ;加入终止液(2mol/L硫酸溶液)100 μ I/孔，酶标仪测定OD492nm值。
优选方式下，在步骤S27中方法3的具体步骤为用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释包被1:10-1 50倍稀释的被检肿瘤细胞裂解液。37°C反应Ih ^PBS-T洗涤;加入封闭液200 μ I/孔，37°C温浴Ih ;加入1:1000-1 :2000倍比稀释的抗c-Myc IgG (2B2) 100 μ I/孔，37°C温浴Ih ;用PBS-T洗涤；将HRP酶标羊抗小鼠IgG做1:5000稀释，100 μ I/孔加入酶标板，37°C温浴Ih ;用PBS-T洗涤；加入邻苯二胺(OPD)液100 μ I/孔，37°C避光反应15min ;加入终止液(2mol/L硫酸溶液)100 μ I/孔，酶标仪测定 0^49211111 值。本发明还提供了一种利用单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的ELISA溶液配制方法，包括洗涤液，PBS-T缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液加入O. l%Tween20)；抗体稀释液，2%脱脂奶粉PBS溶液；包被液，pH 9. 6碳酸盐缓冲液；封闭液，5%脱脂奶粉PBS溶液；底物，邻苯二胺(OPD)液；终止液，2mo 1/L硫酸溶液。本发明所述的三种ELISA测定方法具有操作简便、灵敏度高、检出限低、稳定性和重现性好等优点，对恶性肿瘤的筛选具有重大的意义。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术 人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，包括如下步骤 51、制备C-myc抗原,并纯化,获得纯化的C-myc蛋白； 52、利用所述纯化的C-myc蛋白进行免疫健康Balb/c小鼠； 53、将免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合； 54、筛选阳性杂交瘤细胞； 55、对所述阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，获得2株能够稳定分泌抗C-mycIgG1的克隆及抗C-myc IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株； 56、Balb/c小鼠腹腔内注射两种所述单克隆抗体杂交瘤细胞株，大量制备单克隆抗体； 57、选用以下三种方法中的任意一种,实现快速检测C-Myc 方法1:利用两种抗C-Myc单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的夹心法ELISA法。
方法2 :利用抗c-Myc IgM单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法。
方法3 :利用抗c-Myc IgG单克隆抗体检测肿瘤细胞c-Myc表达量的直接法ELISA法。
2.根据权利要求1所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，步骤SI的具体方法为 511、将含有原核表达载体的pET20b-C-myc表达菌E.coli BL21在37°C震荡培养，170rpm ； 512、经IPTG诱导后，收集菌体，超声波打碎、利用镍柱子层析纯化。
3.根据权利要求2所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，SI的具体方法为将含有原核表达载体pET20b-C-myc表达菌的E. coliBL21在37°C震荡培养，170rpm ;菌液 OD6ticinm 值为 0. 4-0. 6 时，经 l_2mM IPTG 诱导 1-3 小时后，6500rmp 离心 IOmin收集细胞，悬浮，破碎超声破碎仪破碎细胞lOmin，2-8M尿素进行变性2h后再复性，经AKATA仪用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，最后得到90-95%以上纯度的C-Myc蛋白。
4.根据权利要求3所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，S2具体步骤为利用原核表达并纯化的C-myc蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，将抗原注射入健康Balb/c小鼠腹腔内，0. 4ml/只，抗原量为50-100 y g/只；首次免疫14天后，改用弗氏不完全佐剂与同体积的抗原量充分乳化进行第2次免疫，抗原量不变；第28天，按照100-200 yg/只抗原量对小鼠进行第三次免疫，小鼠的抗体效价达到了1:64000-1 1280000。
5.根据权利要求4所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，S3具体步骤为Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以5:1-10:1的比例混合于50ml离心管中，1200rpm、5min离心，弃上清，在25s_30s内迅速滴入37°C预热的50%的PEG1000约0. 5ml并轻轻混匀，700rpm、2min离心，再沿管壁缓慢加入37°C预热的RPM1-1640基础培养基15ml,使试管做划圆样运动约2min,离心1400rpm、5min,弃上清，同法再清洗I次。沿管壁缓慢加入37°C预热的HT培养基30ml，轻轻混匀融合细胞。
6.根据权利要求5所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，S5具体步骤为当杂交瘤细胞集落生长40-60%以上时，用ELISA方法筛选阳性孔； 针对阳性孔，用HT培养基稀释细胞，进行亚克隆。培养第8-9天，对标记的单克隆细胞孔的上清进行ELISA检测，筛选阳性克隆。
7.根据权利要求6所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，S6具体步骤为向健康雌性Balb/c小鼠腹腔内注射高压灭菌后的液体石蜡油，0. 4-0. 6ml/只。一周后，再向其腹腔注射能稳定分泌C-myc抗体的杂交瘤细胞，0. 5ml/只，细胞数约为2-5 X IO6 个； 10-14天后，待小鼠腹部明显膨大并行动迟缓时，收集腹水，3000rpm、IOmin离心，弃去脂肪和石蜡油，收集中层澄清腹水，_20°C冻存备用。2B2及2A9克隆的小鼠腹水效价分别为1:64000、1:32000。
8.根据权利要求7所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，S7中方法I的具体步骤为 用pH 9. 6的碳酸盐缓冲液稀释包被抗C-myc IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株，使浓度达到 5-20 u g/ml ； 用PBS-T洗漆,200 u I/孔,每次30s后甩干洗板液，重复二次； 加入1:10-1 50倍稀释的被检肿瘤细胞裂解液，37°C反应Ih ； 用PBS-T洗涤；加入封闭液200 u I/孔，37°C湿盒温浴Ih ； 加入1:1000-1 :2000倍比稀释的抗C-myc IgM的单克隆抗体杂交瘤细胞株，100 yl/孔，37 °C湿盒温浴Ih; 用PBS-T洗涤；将HRP酶标羊抗小鼠IgG做1:5000稀释，100 U I/孔加入酶标板，37°C湿盒温浴Ih ； 用PBS-T洗涤；加入邻苯二胺液100 u I/孔，37°C避光反应15min ； 加入终止液，2mol/L硫酸溶液，100 u I/孔，酶标仪测定OD492nm值。
9.根据权利要求7所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，S7中方法2的具体步骤为 用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释包被1:10-1 50倍稀释的被检肿瘤细胞裂解液。用PBS-T洗涤，200 iil/孔，每次30s后甩干洗板液，重复三次；加入封闭液200iil/孔，37°C温浴 Ih ;加入1:1000-1 :2000 倍比稀释的抗 C-Myc IgM (2A9) 100 iil/孔，37。。温浴 Ih ；用PBS-T洗涤^fHRP酶标羊抗小鼠IgM做1:5000-1:10000稀释，100 yl/孔加入酶标板，37°C温浴Ih ;用PBS-T洗涤；加入邻苯二胺(OPD)液100111/孔，371避光反应15min ;加入终止液(2mo 1/L硫酸溶液)100 u I/孔，酶标仪测定OD492nm值。
10.根据权利要求7所述利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELISA法，其特征在于，在步骤S7中方法3的具体步骤为 用pH 9. 6的碳酸盐缓冲液稀释包被1:10-1 50倍稀释的被检肿瘤细胞裂解液。37°C反应Ih ^PBS-T洗涤;加入封闭液200iU/孔，37°C温浴Ih ;加入1:1000-1 :2000倍比稀释的抗c-Myc IgG(2B2)100 U I/孔，37°C温浴Ih ;用PBS-T洗涤；将HRP酶标羊抗小鼠IgG做1:5000稀释，100 iil/孔加入酶标板，37°C温浴Ih ;用PBS-T洗涤;加入邻苯二胺(OPD)液100 iil/孔，37°C避光反应15min ;加入终止液(2mol/L硫酸溶液)100 U I/孔，酶标仪测定 OD492nm 值。
全文摘要
本发明一种利用单克隆抗体快速检测C-Myc的ELI SA法，通过蛋白纯化技术将原核表达C-Myc蛋白提纯；进行免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经ELISA法筛选，亚克隆及单克隆抗体Ig亚型鉴定，获得2株能够稳定分泌抗C-myc IgG1的克隆及抗C-myc IgM克隆。利用抗c-Myc IgG1抗体以及抗c-Myc IgM抗体，建立快速检测c-Myc的一种夹心法ELISA法和两种直接法ELISA法。本发明对C-myc蛋白样品进行准确测定，可检测的C-myc蛋白浓度范围为0.01～1000pmol/L，检出下限为0.01～0.05pmol/L，大大提高了检测C-Myc的特异性和敏感性，操作简单、重复性高，本发明检测肿瘤组织中的C-Myc的表达量，为恶性肿瘤的筛选提供实验数据。
文档编号G01N33/531GK103048458SQ20121049668
公开日2013年4月17日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者李文哲, 金锦花 申请人:大连大学