生产单克隆IgA抗体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及单克隆IgA抗体、包含该单克隆IgA抗体的经口或经肠道的组合物和 包含该单克隆IgA抗体的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 对活体来说，肠道内与体外相当，总是暴露于很多种且大量的肠内固有细菌、病毒 和来源于食物等的抗原。这些肠内固有细菌形成肠内细菌丛（下文中，有时将其称为"肠内 细菌群"）。
[0003] 众所周知，肠内细菌丛通过由肠上皮细胞等构成的粘膜面对活体履行各种功能， 还已经发现当不存在肠内细菌时，肠道免疫系统不能正常发展（非专利文献1至3)。
[0004] 如果肠内细菌丛发生变化，并且宿主和肠内细菌之间的共生关系被破坏，则肠道 免疫系统会被过度刺激，而破坏肠道免疫系统的体内平衡，进而诱发炎症性肠病、结直肠 癌、哮喘、变态反应和肥胖症等多种疾病。鉴于此，已知肠道免疫系统不仅在消除病原体等 中起到重要作用，而且在维持整个免疫系统的体内平衡上也起到重要作用（非专利文献4 至7)。
[0005] 消化管的粘膜组织表面是固有细菌、病原性微生物和过敏原等抗原侵入活体的途 径之一，它们作为来自外部环境的很多病原性微生物的侵入部位受到持续攻击，并且暴露 于各种抗原。识别和/或应答以这些病原性微生物为主的外来抗原的系统被称为粘膜免疫 系统。负责粘膜免疫系统的很多细胞存在于消化管的粘膜组织表面的正下方，这些细胞针 对病原性微生物、食物抗原、过敏原、外源性外来抗原等进行免疫应答，形成动态的免疫组 织。
[0006] 粘膜免疫系统构成针对通过由肠上皮细胞构成的粘膜面吸收的外源性外来抗原 以来源于肠道的IgA抗体为中心的独特的免疫系统。肠道来源的IgA抗体不仅以T细胞 依赖的方式在特定组织内产生，而且由在肠道粘膜固有层中散布的产生抗体的细胞大量产 生，其中特定组织是免疫应答的部位，诸如派伊尔氏淋巴集结（Peyer'spatches)、肠系膜 淋巴结和孤立淋巴滤泡（isolatedlymphoidfollicles)(非专利文献8和9)。
[0007] 肠道来源的IgA抗体的功能之一是消除病原体。被分泌到管腔侧的肠道来源的IgA抗体与肠腔中的病原体及它们的毒素结合，并且中和它们。或者，当肠道来源的IgA抗 体自身被分泌到管腔侧时，肠道来源的IgA抗体与侵入肠上皮细胞内、粘膜固有层等的病 原体、毒素等结合，中和它们，同时消除它们。肠道来源的IgA抗体的功能特点是，它们不引 起炎症反应，这与普通抗体参与的全身免疫系统的反应不同（非专利文献10至12)。
[0008] 肠道来源的IgA抗体的另一功能是维持肠内固有细菌与宿主之间的共生关系。肠 道来源的IgA抗体不仅识别和结合病原体，而且也识别和结合固有细菌，以防止固有细菌 过多地进入粘膜中。而且认为，不仅消除固有细菌而且与固有细菌结合的肠道来源的IgA 抗体担载于上皮细胞上的粘液素层（mucinlayer)中，与固有细菌一起形成生物膜而防止 病原体与上皮细胞接触或侵入上皮细胞中（非专利文献13和14)。
[0009] 在这些肠道粘膜免疫系统，特别是体液免疫系统的构建中，已知抗体的体细胞突 变和类型转换起到重要作用。体细胞突变是活体内提供的机制，以使产生抗体的B细胞的 免疫球蛋白基因多样化并且产生高亲和性抗体。另一方面，抗体的类型转换是在抗体的可 变区不变化，而使Η链恒定区的结构发生改变的现象，即在活体内选择的产生IgM抗体的细 胞中，改变类型以生成与该IgM具有相同的可变区的IgG抗体、IgE抗体、IgA抗体等其它类 型的免疫球蛋白。通过组合这两种现象，产生具有多种抗原结合位点的多种抗体，并且相对 于每一抗原结合位点产生每一种类型的抗体，从而可以适当地调节身体的免疫功能。
[0010] 已知体细胞突变和类型转换都需要活化诱导胞苷脱氨酶（AID)蛋白质。已知AID 蛋白质的N末端侧参与体细胞突变，同时C末端侧参与类型转换（非专利文献15和16)。 在体细胞突变中，AID很有可能在抗体基因中引起DNA断裂，而DNA断裂会触动突变引入到 抗体基因中（非专利文献17)。
[0011] 此外，已知在AID蛋白质的N末端侧的第23位的甘氨酸替换成丝氨酸而引入突变 的表达AID-G23S的小鼠（AIDG23S小鼠）中，由于发生类型转换，充分产生每一类型的抗 体，但是不发生体细胞突变，降低了抗体的抗原结合性（非专利文献18)。
[0012] 炎症性肠病难以治愈，因此被指定为难治的疾病。该疾病可举出由于宿主免疫系 统和肠内细菌之间的平衡被破坏，即在肠内细菌的异常增殖、肠内细菌丛的病变所引起的 疾病之一。在临床环境中，该疾病经类固醇和抗TNF抗体等免疫抑制剂的全身给药来治疗。 但是，这些药物需要长期给药，其副作用成为较大问题。因此，期望开发出一种副作用少，且 有效治疗或预防炎症性肠病的肠内疾病的医疗用药物。
[0013] 现有技术文件
[0014] 非专利文献
[0015] 非专利文献 1 :Cerf_BensussanNandGaboriau-RouthiauV，NatRevImmunol 2010 ；10:735
[0016] 非专利文献 2 :HooperLVandMacphersonAJ,NatRevImmunol2010 ； 10:159
[0017] 非专利文献 3 :RoundJLandMazmanianSK,ProcNatlAcadSciUSA 2010 ; 107:12204
[0018] 非专利文献 4 :Vijay-KumarMetal.，Science2010 ;328:228
[0019] 非专利文献 5:ShulzhenkoNetal.，NatMed2011 ;17:1585
[0020] 非专利文献 6:BryLetal·，Science1996 ;273:1380
[0021] 非专利文献 7 :TurnbaughPJetal·，Nature2〇〇6 ;444:l〇27
[0022] 非专利文献 8 :CeruttiAetal·，AnnNYAcadSci2011 ;1238:132
[0023] 非专利文献 9 :FagarasanSetal·，AnnuRevImmunol2010 ；28:243
[0024] 非专利文献 10 :FernandezMIetal·，Immunity2003 ; 18:739
[0025] 非专利文献 11 :MartinoliCetal·，Immunity2007 ;27:975
[0026] 非专利文献 12 :BoullierSetal·，JImmunol2009 ; 183:5879
[0027] 非专利文献 13 :PhaliponAetal·，Immunity2002 ; 17:107
[0028] 非专利文献 I4:MacphersonAJandUhrT,Science2〇〇4 ;3〇3:1662
[0029] 非专利文献 15 :ShinkuraRetal·，NatImmunol2004 ；5:707
[0030] 非专利文献 16 :TaVTetal·，NatImmunol2003 ;4:843
[0031] 非专利文献Π:ChaudhuriJetal.Nature2〇〇3 ;422:726
[0032] 非专利文献 18:WeiMetal.，NatureImmunology12(3)，264-270, 2011
【发明内容】
[0033] 本发明的课题是提供一种具有如下效果的成分：改善或最优化活体内的肠内环 境，抑制肠内腐败，或抑制肠内细菌的异常增殖和/或肠内细菌丛的病变。本发明的另一课 题是提供一种适用于治疗肠内疾病的有效成分。
[0034] 发明人为了解决上述课题进行了广泛研究，发现与具有特定氨基酸序列的蛋白质 的特定部位特异性结合的单克隆IgA抗体抑制肠道免疫系统中的过度应答，具有从大肠的 粘膜固有层的腺管降低中恢复的效果。单克隆IgA抗体的这些效果通过将抗体经口给予个 体得以证实。
[0035] 本发明基于上述发现而完成，包括下面描述的宽泛的实施方式。
[0036] 项目1 :一种单克隆IgA抗体，所述单克隆IgA抗体与丝氨酸羟甲基转移酶的第 11~333位氨基酸结合。
[0037] 另外，在项目1中描述的本发明的实施方式包括在以下项目1-1至1-17中描述的 关于单克隆IgA抗体的实施方式。
[0038] 项目1-1 :根据项目1所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体与丝氨 酸羟甲基转移酶的第25~44位氨基酸结合。
[0039] 项目1-2 :根据项目1所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗体与丝氨 酸羟甲基转移酶的第25~28位氨基酸结合。
[0040] 项目1-3 :根据项目1、1-1或1-2所述的单克隆IgA抗体，其中，所述单克隆IgA抗 体包括重链可变区和/或轻链可变区，
[0041] 该重链可变区包含：（1)由SEQIDN0:3、13、23、33或43所示的氨基酸序列组成 的重链CDR1，（2)由SEQIDN0:4、14、24、34或44所示的氨基酸序列组成的重链CDR2， 和（3)由SEQIDN0:5、15、25、35或45所示的氨基酸序列组成的重链⑶R3;
[0042] 该轻链可变区包含：（1)由SEQIDN0:8、18、28、38或48所示的氨基酸序列组成 的轻链⑶R1，（II)由SEQIDN0:9、19、29、39或49所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R2， 和（III)由SEQIDN0:10、20、30、40或50所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[0043] 项目1-4 :根据项目1和1-1至1-3中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所 述单克隆IgA抗体包括：由SEQIDN0:2、12、22、32或42所示的氨基酸序列组成的重链可 变区，和/或由SEQIDN0:7、17、27、37或47所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
[0044] 项目1-5 :根据项目1和1-1至1-4中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所 述单克隆IgA抗体包括：由SEQID勵:1、11、21、31或41所示的氨基酸序列组成的重链，和 /或由SEQIDN0:6、16、26、36或46所示的氨基酸序列组成的轻链。
[0045] 项目1-6 :根据项目1和1-1至1-5中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所 述单克隆IgA抗体抑制至少两种肠内细菌的生长。
[0046] 项目1-7 :根据项目1和1-1至1-6中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，肠 内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌（Prevotella)属的细 菌、属于拟杆菌（Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌（Megamonas)属的细菌、属于双歧 杆菌（Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌（Faecalibacterium)属的细菌、属于奠 球菌（Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌（Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚菌 (Blautia)属的细菌、属于真细菌（Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌（Roseburia)属 的细菌、属于乳酸菌（Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌（Clostridium)属的细菌、属 于埃希氏菌（Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌（Staphylococcus)属的细菌、属于 肠球菌（Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌（Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌 (Enterorhabdus)属的细菌。
[0047] 项目1-8 :根据项目1和1-1至1-7中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中， 肠内细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：产黑色普雷沃菌（Prevotella melaninogenica)、普通拟杆菌（Bacteroidetesvulgatus)、单形巨单胞菌（Megamonas funiformis)、超巨巨单胞菌（Megamonashypermegale)、两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)、普氏柔嫩梭菌（Faecalibacteriumprausnitzii)、规则奠球菌（Coprococcus eutactus)、卵形瘤胃球菌（Ruminococcusobeum)、延展布劳迪亚菌（Blautiaproductus)、 拟球劳迪亚菌（Blautiacoccoides)、真肠真杆菌（Eubacteriumrectale)、肠性罗氏菌 (Roseburiaintestinalis)、艰难梭菌（Clostridiumdifficile)、大肠杆菌（Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)、鼠乳杆菌（Lactobacillusmurinus)、 干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei)、奠肠球菌（Enterococcusfaecalis)、黄褐假单胞菌 (Pseudomonasfulva)和粘膜肠杆菌（Enterorhabdusmucosicola) 〇
[0048] 项目1-9 :根据项目1和1-1至1-8中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所 述单克隆IgA抗体是IgA^ IgA 2。
[0049] 项目1-10 :根据项目1和1-1至1-9中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中，所 述单克隆IgA抗体是包含J链的多聚体。
[0050] 项目1-11 :根据项目1和1-1至1-10中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中， 所述单克隆IgA抗体包含分泌因子。
[0051] 项目1-12 :根据项目1和1-1至1-11中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中， 所述单克隆IgA抗体具有来源于相同物种的氨基酸序列。
[0052] 项目1-13 :根据项目1和1-1至1-12中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中， 所述单克隆IgA抗体具有来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑 猩猩或人的任意氨基酸的氨基酸序列。
[0053] 项目1-14 :根据项目1和1-1至1-11中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其中， 所述单克隆IgA抗体具有来源于不同物种的氨基酸序列。
[0054] 项目1-15 :根据项目1、1-1至1-11和1-14中任一项目所述的单克隆IgA抗体，其 中，所述单克隆IgA抗体具有来源于选自由小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、 猴、鸡、黑猩猩和人组成的组中的两种以上物种的氨基酸序列。
[0055] 项目1-16 :根据项目1、1-1至1-11、1-14和1-15中任一项目所述的单克隆IgA抗 体，其中，所述单克隆IgA抗体是人源化抗体。
[0056] 项目1-17 :根据项目1、1-1至1-11、1-14和1-15中任一项目所述的单克隆IgA抗 体，其中，所述单克隆IgA抗体是嵌合抗体。
[0057] 项目2 : -种项目1所述的单克隆IgA抗体的制造方法，其中，所述方法包括以下 的工序1和工序2 :
[0058] (1)工序1 :将从肠道粘膜固有层收集的B细胞与其它类型的细胞混合并融合，制 备杂交瘤；和
[0059] (2)工序2 :培养在工序1中制备的该杂交瘤，确定产生与至少两种肠内细菌结合 的单克隆IgA抗体的细胞，从该细胞中回收该IgA抗体。
[0060] 另外，在项目2中描述的本发明的实施方式广泛地包括在以下项目2-1至2-18中 描述的单克隆IgA抗体制造方法的实施方式。
[0061] 项目2-1 :根据项目2所述的制造方法，其中，所述B细胞是产生IgA抗体的细胞。
[0062] 项目2-2:根据项目2或2-1所述的制造方法，其中，所述肠道粘膜固有层来源于 小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩或人。
[0063] 项目2-3 :根据项目2、2_1和2-2所述的制造方法，其中，其它细胞是骨髓瘤细胞。
[0064] 项目2-4:根据项目2和2-1至2-3中任一项目所述的制造方法，其中，所述其它 细胞来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩或人。
[0065] 项目2-5 :根据项目2和2-1至2-4中任一项目所述的制造方法，其中，肠内细 菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：属于普氏菌（Prevotella)属的细菌、 属于拟杆菌（Bacteroides)属的细菌、属于巨单胞菌（Megamonas)属的细菌、属于双歧杆 菌（Bifidobacterium)属的细菌、属于柔嫩梭菌（Faecalibacterium)属的细菌、属于奠 球菌（Coprococcus)属的细菌、属于瘤胃球菌（Ruminococcus)属的细菌、属于布劳迪亚 (Blautia)属的细菌、属于真细菌（Eubacterium)属的细菌、属于罗氏菌（Roseburia)属 的细菌、属于乳酸菌（Lactobacillus)属的细菌、属于梭菌（Clostridium)属的细菌，属 于埃希氏菌（Escherichia)属的细菌、属于葡萄球菌（Staphylococcus)属的细菌、属于 肠球菌（Enterococcus)属的细菌、属于假单胞菌（Pseudomonas)属的细菌和属于肠杆菌 (Enterorhabdus)属的细菌。
[0066] 项目2-6 :根据项目2和2-1至2-5中任一项目所述的制造方法，其中，肠内 细菌是选自由以下细菌组成的组中的至少两种细菌：产黑色普雷沃菌（Prevotella melaninogenica)、普通拟杆菌（Bacteroidetesvulgatus)、单形巨单胞菌（Megamonas funiformis)、超巨巨单胞菌（Megamonashypermegale)、两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum)、普氏柔嫩梭菌（Faecalibacteriumprausnitzii)、规则奠球菌（Coprococcus eutactus)、卵形瘤胃球菌（Ruminococcusobeum)、延展布劳迪亚菌（Blautiaproductus)、 拟球劳迪亚菌（Blautiacoccoides)、真肠真杆菌（Eubacteriumrectale)、肠性罗 氏菌（Roseburiaintestinalis)、鼠乳杆菌（Lactobacillusmurinus)、干酪乳杆菌 (Lactobacilluscasei)、艰难梭菌（Clostridiumdifficile)、大肠杆菌（Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)、奠肠球菌（Enterococcusfaecalis)、 黄褐假单胞菌（Pseudomonasfulva)和粘膜肠杆菌（Enterorhabdusmucosicola) 〇
[0067] 项目2-7:根据项目2和2-1至2-6中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克 隆IgA抗体是IgA^IgA2。
[0068] 项目2-8:根据项目2和2-1至2-7中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克 隆IgA抗体为包含J链的多聚体。
[0069] 项目2-9:根据项目2和2-1至2-8中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克 隆IgA抗体包含分泌因子。
[0070] 项目2-10 :根据项目2和2-1至2-9中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克 隆IgA抗体具有来源于相同物种的氨基酸序列。
[0071] 项目2-11 :根据项目2和2-1至2-10中任一项目所述的制造方法，其中，所述单 克隆IgA抗体具有来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、黑猩猩或 人的氨基酸序列。
[0072] 项目2-12 :根据项目2和2-1至2-9中任一项目所述的制造方法，其中，所述单克 隆IgA抗体具有来源于不同物种的氨基酸序列。
[0073] 项目2-13 :根据项目2、2-1至2-9和2-12中任一项目所述的制造方法，其中，所述 单克隆IgA抗体具有来源于选自由小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、驴、猪、牛、马、鸡、猴、 黑猩猩和人组成的组中的两种以上物种的氨基酸序列。
[0074] 项目2-14 :根据项目2、2-1至2-9、2-12和2-13中任一项目所述的制造方法，其 中，所述单克隆IgA抗体是人源化抗体。
[0075] 项目2-15 :根据项目2、2-1至2-9、2-12和2-13中任一项目所述的制造方法，其 中，所述单克隆IgA抗体是嵌合抗体。
[0076] 项目2-16 :根据项目2和2-1至2-15中任一项目所述的制造方法，其中，所述单 克隆IgA抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，
[0077] 该重链可变区包含：⑴由SEQIDN0:3、13、23、33或43所示的氨基酸序列组成 的重链CDR1，（2)由SEQIDN0:4、14、24、34或44所示的氨基酸序列组成的重链CDR2， 和（3)由SEQIDN0:5、15、25、35或45所示的氨基酸序列组成的重链⑶R3;
[0078] 该轻链可变区包含：⑴由SEQIDN0:8、18、28、38或48所示的氨基酸序列组成 的轻链⑶R1，（II)由SEQIDN0:9、19、29、39或49所示的氨基酸序列组成的轻链⑶R2， 和（III)由SEQIDN0:10、20、30、40或50所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[0079] 项目2-17 :根据项目2和2-1至2-16中任一项目所述的制造方法，其中，所述单 克隆IgA抗体包括：由SEQID勵:2、12、22、32或42所示的氨基酸序列组成的重链可变区， 和/或由SEQIDN0:7、17、27、37或47所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
[0080] 项目2-18 :根据项目2和2-1至2-17中任一项目所述的制造方法，其中，所述单 克隆IgA抗体包括：由SEQID勵:1、11、21、31或41所示的氨基酸序列组成的重链，和/或 由SEQIDN0:6、16、26、36或46所示的氨基酸