专利名称：一种抗cd25的嵌合单克隆抗体的生产方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，更具体地涉及一种抗CD25的嵌合单克隆抗体的生产方法，以及用于该方法的表达载体和宿主细胞。
背景技术：
器官移植后的急性排斥反应较常见，这种反应可能会引起移植肾脏的坏死或者移植肾功能衰退。因此，能够降低和减弱这类反应的药物对于器官移植的成功与否至关重要。临床上一般采用免疫抑制剂对器官移植病人进行治疗，抑制移植排斥反应的发生或减轻反应程度。因此，接受肾移植者不得不终身服用免疫抑制药物以达到1.合理应用以预防和治疗排斥反应(保护异己的肾脏)；2.保持患者适度的免疫抵抗力(保护患者本身)。
新的免疫抑制剂的研制，使临床肾移植得到更为广泛的开展，肾移植数量急剧增长，效果明显提高，肾移植一年存活率在先进的移植中心已超过85％，术后大多数患者恢复正常生活和工作。其中免疫抑制剂在预防和治疗肾移植排斥反应中起了关键作用。然而，迄今应用于临床的免疫抑制剂并没有达到非常满意的效果。虽然移植的肾一年存活率达80-90％，但急性排斥反应发生率仍高达50％。
抗CD25的嵌合单克隆抗体为一种新型免疫抑制剂，通过结合与和封闭IL-2受体，特异性阻断IL-2与其受体的结合，从而减少急性排异反应的发生，与三联免疫抑制剂合用，可显著减少急性器官移植排异反应的发生。
因此，本领域迫切需要开发该新型免疫抑制剂的高效表达方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种抗CD25的嵌合单克隆抗体的生产工艺。
本发明的另一目的是提供用于该生产工艺的表达载体和宿主细胞。
在本发明的第一方面，提供了两种表达载体，它们分别含有抗CD25的嵌合单克隆抗体的重轻链编码序列(包括DNA序列或RNA序列)。
在本发明的第二方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的表达载体或所述抗CD25的嵌合单克隆抗体的编码序列。更佳地，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。
在本发明的第三方面，提供了一种生产抗CD25的嵌合单克隆抗体的方法，它包括步骤(a)在适合表达抗CD25的嵌合单克隆抗体的条件下，用发酵罐培养本发明上述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出抗CD25的嵌合单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的表达载体是含病毒启动子的表达载体，或者所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。
在另一优选例中，在步骤(a)中进行高密度无血清悬浮培养。
在另一优选例中，所述的步骤(b)包括步骤(i)细胞培养上清离心获得上清液；(ii)通过亲和层析进行初步纯化；(iii)层析纯化，所述的层析纯化选自阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析及其组合。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，将抗CD25的嵌合单克隆抗体构建入合适的表达载体，然后转化哺乳动物细胞，转化的哺乳动物细胞经培养，表达出抗CD25的嵌合单克隆抗体。生产工艺高效稳定。在此基础上完成了本发明。
在另一优选例中，用本发明构建的表达载体共转获得的哺乳动物细胞(简称为“工程细胞”)，经高密度无血清悬浮培养，抗CD25的嵌合单克隆抗体以活性形式存在于细胞培养上清，同时简便纯化工艺，通过简便的二步纯化方法，即可得到纯度达95％的纯品，获得高表达、高得率、高活性、极具产业化价值的一种生产抗CD25的嵌合单克隆抗体的方法。
开发的抗CD25的嵌合单克隆抗体，通过结合和封闭IL-2受体，特异性阻断IL-2与其受体的结合，从而减少急性排异反应的发生。与三联免疫抑制剂配合使用，可以显著减少急性器官移植排异反应的发生。同时，抗CD25的嵌合单克隆抗体为嵌合抗体，在克服鼠源性单克隆抗体的免疫原性的同时保留了其独特的抗体亲和力和特异性，不仅提高了治疗效果，而且降低了产品的副作用。
本发明的发明点主要在于抗CD25的嵌合单克隆抗体高表达工程细胞获得、工程细胞优化培养以及产物的分离等技术优化创新。
适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞。
在本发明中，工程细胞表达抗CD25的嵌合单克隆抗体的培养条件进行了优化，哺乳动物细胞通常需要在含血清的培养基中进行培养，需要对细胞进行无血清的适应过程后，让细胞可以在无血清培养基中正常的生长。同时由于该细胞使用的是GS表达系统，需要使用不含谷氨酰胺的培养基，才可以表达抗CD25的嵌合单克隆抗体。
此外，通过控制培养基的各营养成分，控制培养时候的溶氧(DO)、pH、温度、搅拌速度等因素，可以进一步提高表达量。
在培养表达抗CD25的嵌合单克隆抗体后，对表达的抗CD25的嵌合单克隆抗体进行分离。
由于表达的抗CD25的嵌合单克隆抗体存在于培养上清，那么培养上清液可以通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。
适用于本发明的层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
(a)亲和层析选择Protein A-Sepharose亲和凝胶介质，低pH缓冲液洗脱。
(b)离子交换层析。
经过2-3步纯化，可得到抗CD25的嵌合单克隆抗体纯品，纯化得率40％以上，纯度95％以上。在本发明中，通过培养条件的优化，可将抗CD25的嵌合单克隆抗体表达量从15mg/升提高到100mg/升。
纯化后抗CD25的嵌合单克隆抗体可用常规技术制成各种剂型。
在本发明的一个实例中，通过筛选获得高效、稳定表达的抗CD25的嵌合单克隆抗体工程细胞(哺乳动物细胞)。经高密度无血清悬浮培养，抗CD25的嵌合单克隆抗体以可溶形式存在于培养液上清，表达水平高，占菌体总蛋白50％左右，抗CD25的嵌合单克隆抗体表达量达100～125mg/L上清液。由于表达水平较高，抗CD25的嵌合单克隆抗体又具有天然活性，避免了复杂的复性过程，通过简便、快速的二步纯化方法，即获得高质量的抗CD25的嵌合单克隆抗体纯品，每升培养液可得抗CD25的嵌合单克隆抗体纯品45mg，产品纯度95％以上。
中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得抗CD25的嵌合单克隆抗体纯品约45mg或更多，因此适合产业化生产。
本发明的优点在于(1) 创新的生产工艺，采用新型NSO表达体系与无血清悬浮培养技术；(2) 表达工艺简单，表达量高。通过控制关键的细胞培养工艺条件，使表达水平达到100mg/L。
(3) 纯化工艺简便，回收率高。由于蛋白是以可溶形式表达于上清，因此简化了纯化工序，使纯化回收率大大提高，使大规模生产抗CD25的嵌合单克隆抗体成为可能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1高表达工程细胞获得用FuGENE6(Boehringer Manheim)试剂将获得的编码抗CD25的嵌合单克隆抗体重轻链的重组表达载体共转染COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)(5000细胞/ml)，经过三天培养，上清液中分泌的抗体用ELISA检测。获得高表达的细胞株。
实施例2选择最佳培养基由种子细胞库复苏无血清细胞株一支，接种到T25方瓶中进行培养，48小时后，按照1∶3的比例将细胞接种入3个T25方瓶中，后可以按照1∶3的比例进行扩增培养。
将细胞以相同的密度接种入不同的培养基中，考察48小时后细胞的数目和表达量。实验数据表明，细胞在B+E+P培养基中的细胞生长速度和产物的表达量均达到最高。所以选用B+E+P培养基作为该细胞的扩增培养基。
实施例3工程细胞高密度无血清悬浮培养研究我们考察了表达抗CD25的嵌合单克隆抗体的工程细胞在BDCHO、BD+excel620+primitone、excell 620+DOMA+primitone以及Excell 620培养基中的适应过程。
综上所述，拟采用BD+excel 620+primitone培养基作为该细胞扩增的无血清培养基，进行细胞在250ml spinner中扩增培养，得到一定量的培养上清，提供纯化进行纯化工艺研究，并得到一定量的纯品提供质控进行结构确证方面的工作。
实施例4抗CD25的嵌合单克隆抗体的纯化细胞培养液4℃下8900rpm离心20min，得上清。
1.层析1(亲和层析)层析介质rProteinA缓冲液溶液APBS(20mM PB+0.1M NaCl，pH7.0)溶液B50mM Gly，pH2.8上样将细胞培养液离心上清上样。
清洗上样后用5CV的溶液A清洗层析柱。
梯度清洗后用直接用100％的溶液B洗脱。
收集收集抗CD25的嵌合单克隆抗体样品峰。
样品处理用调节缓冲液(50mM Gly，pH7.2)调节样品pH至7.02.层析2(阳离子层析)层析介质 SP Sepharose FF缓冲液溶液APB(10mM PB，pH7.0)溶液BPBS(10mM PB+1M NaCl，pH7.0)上样将中和后的含抗CD25的嵌合单克隆抗体的溶液上样。
清洗上样后用5CV的溶液A清洗层析柱。
梯度清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。
收集收集抗CD25的嵌合单克隆抗体样品峰。
样品经过此二步纯化，即亲和层析、阳离子层析以后，纯度提高至95％以上。
实施例5抗CD25的嵌合单克隆抗体的生物活性检测用常规的MTT显色法测定抗CD25的嵌合单克隆抗体对增殖的新鲜人外周血淋巴细胞的抑制作用，其中新鲜人外周血淋巴细胞是通过加入激活剂激活使其增殖。结果表明，纯化后的抗CD25的嵌合单克隆抗体具有抑制淋巴细胞的增殖作用，且活性与市售同类单抗的活性相同。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种生产抗CD25的嵌合单克隆抗体的方法，其特征在于，它包括步骤(a)在适合表达抗CD25的嵌合单克隆抗体的条件下，用发酵罐培养宿主细胞；(b)从培养物中分离出表达的嵌合单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞含有编码抗CD25的嵌合单克隆抗体的表达载体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达载体含有编码抗CD25的嵌合单克隆抗体的序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中进行高密度悬浮培养。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括步骤(i)培养液离心获得上清液；(ii)层析纯化，所述的层析纯化选自亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、及其组合。
全文摘要
本发明提供了一种抗CD25的嵌合单克隆抗体的生产方法，以及用于该方法的表达载体和宿主细胞。本生产方法不仅表达量高，而且分离纯化工艺简便。本发明还提供了相应的表达载体和工程细胞。
文档编号C12P21/08GK101092640SQ20061002809
公开日2007年12月26日 申请日期2006年6月23日 优先权日2006年6月23日
发明者黄阳滨, 张翊, 孙九如, 任军, 游磊, 陈子珺, 徐晓燕, 刘勇, 张甘良 申请人:上海新生源医药研究有限公司, 上海新生源生物医药有限公司