一种检测马红球菌病的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，更具体地，设及一种检测马红球菌病的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 马红球菌属于红球菌属，是一种人畜共患的条件性致病菌。该病原菌普遍存在于 自然环境±壤中，调查表明，50~95%的农场±壤中存在该菌。马红球菌可感染人，导致呼 吸道感染症状。该病也是幼龄马骑最常见的疾病之一，发病率可达80%。染病马骑一般呈慢 性或亚急性支气管肺炎症状，有时伴发盲结肠和肠系膜淋己结溃瘍。
[0003] -直W来关于马红球菌的致病机制并不清楚，直至最近研究发现，导致该细菌毒 性的关键是其是否含有一个致病性相关质粒。该质粒含有85~90化的遗传编码DNA，可编 码多个高免疫原性的毒性脂蛋白。其中，毒性相关蛋白A(VapA)为其主要表达蛋白。大量 研究表明，马红球菌的毒性与VapA密切相关。目前，虽有部分重组VapA蛋白表达的报道， 但其表达的蛋白多W包涵体的形式存在，较难应用于实际的医疗诊断和治疗产品的开发和 应用。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供马红球菌致病基因 VapA蛋白的试剂盒和应用。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案予W实现的： 一种检测马红球菌病的化ISA试剂盒，所述试剂盒包括作为免疫原的马红球菌致病基 因VapA重组蛋白MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQIDNO;1所示。
[0006] 优选地，所述试剂盒还包括适于MBP-VapA与抗马红球菌致病基因VapA抗体发生 抗原抗体反应的检测试剂。
[0007] 具体地，所述试剂盒还可W包括包被有MBP-VapA的固相载体、酶标抗体。
[000引另外，本发明所述试剂盒还包括封闭液、洗漆液、显色液、终止液、阳性和阴性对 照。
[0009] 其中，所述阴性对照为胎马血清，阳性对照为马红球菌灭活疫苗免疫的成年马血 清，酶标抗体为羊抗马IgGF油' 2-HRP。
[0010] 本发明通过优化实验，获得最佳的化ISA试剂盒的参数；MBP-VapA的包被浓度为 0. 125ug/mL，阴性对照和阳性对照血清稀释度为1 ;400,羊抗马IgGFab' 2-HRP稀释度为 1 ;20000,封闭液为 0. 5%PVA。
[0011] 本发明还提供一种检测马红球菌病的化ISA试剂盒的制备方法，包括W下步骤： 51. 免疫原的制备如下；扩增VapA基因，并克隆到PMAL-C5X载体上，构建表达载体 PMAL-VapA，将PMAL-VapA转化至原核表达菌，通过IPTG在20°C下诱导、纯化后获得重组蛋 白MBP-VapA; 52. 分别配制酶标抗体羊抗马IgGF油'2-HRP、阴性对照胎马血清、阳性对照马红球菌 灭活疫苗免疫的成年马血清和封闭液PVA获得化ISA试剂盒。
[0012] 马红球菌致病基因VapA蛋白是重要的毒性蛋白，现有技术中关于该蛋白研究较 少。一般纯化出的马红球菌致病基因VapA蛋白多W包涵体的形式存在，从而限制了其实际 应用。申请人通过大量探索发现：将VapA基因与PMAL-C5X载体相连，并配合20°C的诱导 温度可W表达出大量可溶性表达的VapA蛋白。
[0013] 本发明使用PMAL-C5X载体，它可W促进重组表达蛋白的可溶性表达，实验研究表 明，包涵体形式表达重组蛋白影响其氨基酸折叠形成正常的蛋白质S级、四级拓扑结构的 形成，进而影响重组表达蛋白的抗原性和生物活性。本研究首次采用PMAL-C5X为载体，对 马红球菌的致病基因VapA进行了重组，获得重组质粒一PMAL-VapA。
[0014] 另外，发明人通过实验发现，单单使用PMAL-C5X载体，对VapA蛋白的可溶性表达 虽然有促进作用，但作用并不明显，还必须要配合低温诱导，才能够使VapA蛋白大量可溶 性表达。发明人研究了多个诱导温度对VapA蛋白的表达影响，结果显示，只有在20°C时才 能够获得大量的可溶性的VapA蛋白。
[0015] 本发明通过上述方法获得了大量可溶性表达且活性好的VapA蛋白，该蛋白具有 良好的免疫原性，本发明所得到的MBP-VapA更接近马红球菌致病基因VapA的性质。
[0016] 优选地，MBP-VapA的制备方法中，所述原核表达菌在培养至ODe。。值为0. 5~0. 7 后，加入IPTG进行诱导；更优选的，原核表达菌在培养至ODe。。值为0. 6后加入IPTG进行诱 导。
[0017] 优选的，本发明所述IPTG诱导的浓度为0. 3~0. 7mM，诱导时间为8~12h。
[001引更优选地，申请人发现所述原核表达菌在20°C培养下，IPTG诱导浓度为0. 7mM，且 诱导时间为她时，VapA蛋白的表达量最高，且多为可溶性表达。
[0019] 优选地，本发明所述试剂盒的制备方法中，重组蛋白MBP-VapA的包被浓度为 0. 125ug/mL，阴性对照和阳性对照血清稀释度为1 ;400,羊抗马IgGFab' 2-HRP稀释度为 1 ;20000,封闭液为 0. 5%PVA。
[0020] 具体地，重组蛋白MBP-VapA的制备方法包括W下步骤： 51. 重组质粒PMAL-VapA的构建：设计SEQIDNO;2和SEQIDNO;3所述引物扩增 VapA基因，将VapA基因与pZeroBack/blunt载体相连构建质粒pZeroBack-VapA;最后将 PMAL-C5X和测序正确的pZeroBack-VapA进行双酶切后构建表达载体PMAL-VapA; 52. 将PMAL-VapA转化入化21菌中，测序鉴定为阳性之后，将菌液接种于培养基中， 培养至ODe。。值为0. 5~0. 7,加入IPTG诱导后，离屯、重悬菌体，破碎菌体，收集上清，获得可 溶性VapA蛋白。
[0021]S3.上清通过直链淀粉树脂进行亲和层析，获得纯化后的蛋白。
[0022] 优选地，S2中原核表达菌在培养至ODe。。值为0. 6后加入IPTG进行诱导。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下； 本发明提供了一种检测马红球菌病的试剂盒，所述试剂盒包括包括作为免疫原的马红 球菌致病基因VapA重组蛋白MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQIDN0;1所示。用该试剂盒 进行检测，灵敏度高，特异性强，重复性和稳定性都很好，检测临床样本，检出率为大大高于 常规检测，具有实际的临床应用意义。
【附图说明】
[0024]图1为VapA基因的PCR扩增图；其中，1;VapA;2 ;(1化0对照；M;2000bp的DM分 子量标准。
[00巧]图2为重组克隆质粒pZeroBack-VapA的酶切鉴定；其中，1 ;pZeroBack-VapA重组 质粒的公I和I双酶切产物；M;500化P的DNA分子量标准。
[0026] 图3为重组表达质粒PMAL-VapA的测序鉴定结果；下划线部位分别为I与 公I的酶切位点序列。
[0027] 图4为不同诱导温度对蛋白表达量的影响；其中，M;蛋白分子量标准；1 ;IPTG诱 导前的蛋白表达；2-6;分别在101：、151：、201：、281：和371：温度下诱导的蛋白表达。
[002引图5为不同IPTG诱导时间对蛋白表达量的影响；其中，M;蛋白分子量标准；1-8分 别为IPTG诱导0、2、4、8、12、16、20和24小时的蛋白表达。
[0029] 图6为不同IPTG浓度对诱导蛋白表达量的影响；其中，M;蛋白分子量标准；1-7 : 1口16浓度分别为；0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0和1.41111。
[0030] 图7为20°C下0. 7mMIPTG诱导她后表达的蛋白；其中，M;蛋白分子量标准；1;诱 导前化21细菌的蛋白表达；2 ;诱导后化21细菌的蛋白表达；3转化空表达载体PMAk^x 的化21诱导前蛋白表达；4 ;转化空表达载体PMkC5x的化21诱导后蛋白表达；5 ;转化空 表达质粒PMAL-VapA的L21诱导前蛋白表达；6 ;转化表达质粒PMAL-VapA的化21诱导后的 蛋白表达；7 ;经亲和层析纯化后的VapA蛋白巧：诱导表达VapA蛋白的化21菌液超声破碎 上清(含可溶性表达蛋白）;9 ;诱导表达VapA蛋白的化21菌液超声破碎沉淀(含包涵体表达 蛋白）。
[0031] 图8为不同温度诱导表达的VapA蛋白的状态分析；M;蛋白分子量标准；1 ;IPTG诱 导前转化化21 (含PMAL-VapA)的蛋白表达；2和3分别为；20°C诱导表达产物的超声破碎 上清(含可溶性表达蛋白）和沉淀(含包涵体表达蛋白）;4和5分别为；28°C诱导表达产物的 超声破碎上清和沉淀；6和7分别为；37°C诱导表达产物的超声破碎上清和沉淀。
[0032] 图9为纯化后VapA蛋白的Western-blot分析结果；其中，1;纯化的VapA蛋白； M;蛋白分子量标准。
[003引图10为MBP-VapA重组蛋白的DotELISA分析，其中，1至3孔为BSA，蛋白浓度分 别为；0.Img/血、0. 025mg/血、0. 0062