一种天然橡胶颗粒观测方法及其在橡胶植物品系筛查中的应用
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用标记免疫学识别技术的筛查橡胶植物品系的方法，特别是利用标记免疫电镜技术筛查蒲公英、刺莴苣、无花果、银胶菊等橡胶植物品系(特别是橡胶草品系)的方法。
【【背景技术】】
[0002]橡胶植物的橡胶乳液中包含橡胶颗粒，天然橡胶分子即在橡胶颗粒的表面合成。小橡胶颗粒蛋白(SRPP)是橡胶颗粒表面的一种跟天然橡胶合成紧密相关的膜蛋白，其与橡胶植物的产胶能力成正相关关系(参见Oh，S.K.；Kang, H.；Shin, D.H.；Yang, J.；Chow, K.S.；Yeang, Η.Y.；Wagner, B.；Breiteneder, H.；Han, K.H.J.B1l.Chem.1999，274，17132 - 17138.)。因此通过观测一种橡胶植物乳液中的SRPP即可预测该种橡胶植物的产胶能力。
[0003]橡胶草是多年生草本植物，包括菊科蒲公英等。橡胶草含有天然橡胶乳液，能制造天然橡胶。我国面积广大，从温带到亚热带种都可种植橡胶草。因此，中国研宄机构已开始研宄从橡胶草上采集天然胶乳，以制备天然橡胶。但是，橡胶草中含胶量普遍较低。需要从野生的橡胶草中筛选出天然乳胶含量高的橡胶草品系和株，进行人工培育，以大规模推广种植。因此寻找一种橡胶草品系的筛查或筛选的方法，无论从经济意义还是我国的橡胶安全的角度来说具有重大意义。
[0004]普通的电子显微镜可以实现高放大率和高解析度的颗粒物形态分析，例如，使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜，可以清晰地表征纳米颗粒物的大小、形态及其分布特征，从而为相关领域的重要研宄和应用奠定方法学基础。
[0005]普通的电子显微术是通过将橡胶植物乳液样品作喷金或于金属网上固定处理而进行后续的电镜观察，在良好的工作条件下，普通的电子显微术可获得较为清晰的颗粒物电镜图片。
[0006]现有技术中，应用普通的电子显微术可以直接观察到橡胶植物乳液中的颗粒物。但是，由于橡胶植物乳液中可能同时含有多类蛋白、树脂、橡胶分子以及其他颗粒，在普通电子显微镜下这些颗粒显示出类似的图像，所以普通电子显微镜无法区分橡胶植物乳液中的橡胶颗粒，即普通的电子显微术不具有特异性，无法确证所观察到的颗粒物是否为天然橡胶颗粒。
[0007]标记免疫技术是使用放射性核素、荧光素、酶、纳米金颗粒、量子点等标记物质，结合特异性的抗原-抗体反应，而进行的特异性分子识别手段。
[0008]标记免疫技术中，标记免疫电镜技术是将抗原-抗体特异性分子识别反应与高放大倍率和高解析度的电子显微术相结合，标记免疫电子显微技术在临床诊断、疾病治疗及生理病理研宄等领域有着非常广泛的应用，近年来，随着标记技术的进步和电子显微相关设备的不断更新，标记免疫电镜技术的研宄领域不断拓展，应用领域也日趋广泛。【
【发明内容】
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[0009]【发明所要解决的课题】
[0010]本发明所要解决的问题是普通的电子显微镜无法区分橡胶植物乳液中的橡胶颗粒，即普通的电子显微术不具有特异性，无法确证所观察到的颗粒物是否是所期望的目标天然橡胶颗粒，无法判断橡胶植物的产胶能力。
[0011]【解决课题的手段】
[0012]本发明基于橡胶颗粒表面的小橡胶颗粒蛋白，利用标记免疫识别技术，特异性地识别橡胶植物乳液中的橡胶颗粒，判断橡胶植物乳液中的橡胶颗粒含量高低，并通过观察橡胶蛋白标记物的密度分布，快速预测和判断橡胶植物的产胶能力高低，解决产胶橡胶草品系筛查的关键性技术问题。
[0013]具体地说，本发明解决课题的手段如下:
[0014]1.一种观测橡胶颗粒的方法，其特征在于，所述方法利用标记免疫学识别技术进行观测和识别。
[0015]2.如项目I所述的方法，其特征在于，所述橡胶颗粒来自橡胶植物乳液。
[0016]3、如项目I或2所述的方法，其特征在于，所述橡胶植物为橡胶树或者橡胶草，例如，选自由巴西橡胶树、蒲公英、刺莴苣、无花果和银胶菊组成的组中的任意一种。
[0017]4.如项目I至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述标记免疫学识别技术为免疫电镜技术、酶联免疫吸附法、荧光显微镜方法、放射性免疫标记技术、蛋白或基因芯片法或者基于侧流免疫原理的试纸条法。
[0018]5.如项目I至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫学识别技术为免疫电镜技术。
[0019]6、如项目I至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:
[0020](I)以取自橡胶植物的橡胶乳液作为待测样品，使其中的小橡胶颗粒蛋白(SRPP)与第一抗体充分接触，使两者结合；
[0021](2)使标记物标记过的第二抗体与已标记第一抗体的待测样品充分接触，使两者结合，得到抗体标记样品；
[0022](3)对抗体标记样品进行观测和识别。
[0023]7、如项目I至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一抗体为源自于小橡胶粒子蛋白的抗体，优选为鼠源小橡胶粒子蛋白抗体，所述第二抗体为第一抗体的抗体。
[0024]8、如项目I至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二抗体为金标记抗体。
[0025]9、如项目I至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:
[0026](I)使四氧化锇与采集自橡胶植物的橡胶乳液于室温下固定I小时，得到经四氧化锇固定的橡胶乳液，然后滴一小滴将该所述经四氧化锇固定的橡胶乳液至聚乙烯醇缩甲醛化的镍网上并风干；
[0027](2)在样品与第一抗体结合之前，将经风干的镍网依次浸泡在去离子水、PBS缓冲液和含有牛血清蛋白(BSA)、TritonlOO的PBS缓冲液中；
[0028](3)使所述镍网与第一抗体在37°C充分结合120分钟；
[0029](4)取出所述镍网，依次滴加含有脱脂奶粉和Tween 20的PBS缓冲液、PBS缓冲液；
[0030](5)使所述镍网与第二抗体在室温下充分结合2小时；
[0031](6)将镍网依次用TBS-Tween 20、TBS洗涤，最后用去离子水洗涤4次；
[0032](7)将镍网风干后使用透射电镜进行观测。
[0033]10、如项目I至9中任一项所述的方法在橡胶植物尤其是橡胶草上针对橡胶产量进行的品系筛查中的应用。
[0034]11、项目10所述的应用，其中，所述品系筛查是定性筛查和/或定量筛查。
[0035]【发明的效果】
[0036]本发明利用标记免疫识别技术，特异性地识别橡胶植物乳液中的橡胶颗粒，并通过观察橡胶蛋白标记物的密度分布，实现了快速定量判断橡胶植物乳液中的橡胶颗粒含量高低及快速判断橡胶植物产胶能力高低，解决了产胶橡胶草品系筛查的关键性技术问题。
【【附图说明】】
[0037]图1是实施例1(有第一抗体)的透射电镜照片。
[0038]图2是图1的放大图。
[0039]图3是比较例I (无第一抗体)的透射电镜照片。
[0040]图4是实施例2(有第一抗体)的透射电镜照片。
[0041 ]图5是比较例2 (无第一抗体)的透射电镜照片。
[0042]图6是胶体金免疫电镜原理示意图。
【【具体实施方式】】
[0043]本发明的利用标记免疫技术特异性地识别橡胶植物乳液中的橡胶颗粒的方法可以适用于橡胶树、蒲公英、刺莴苣、无花果或者银胶菊。本发明的方法更适用于橡胶草，特别适用于蒲公英。
[0044]本发明的方法包括如下步骤:
[0045](I)以提取出的橡胶乳液作为待测样品，使其中的SRPP与第一抗体充分接触，使两者结合；
[0046](2)使标记物标记的第二抗体与待测样品充分接触，使两者结合；
[0047](3)使用识别技术观察、识别天然橡胶颗粒。
[0048]更具体地说，本发明的方法包括如下步骤:
[0049](I)将利用上述过膜法采集和纯化的橡胶植物乳液使用I质量％四氧化锇溶液(四氧化锇溶于50mM 二甲胂酸钠缓冲液中)，置于室温下I小时固定，滴一小滴四氧化锇溶液至聚乙烯醇缩甲醛化的镍网上风干；
[0050](2)在第一抗体结合之前(即，第一抗体与样品(带有橡胶颗粒的镍网)结合之前)，将镍网依次浸泡在去离子水、PBS缓冲液和含有I质量％牛血清蛋白(BSA)、0.5体积％ TritonlOO的PBS缓冲液中(在各液体中分别浸泡5min)
[0051](3)将SRPP抗体(鼠源)(第一抗体)1:200稀释，得到稀释液，将镍网在37°C下充分接触120min所述稀释液，使载在镲网上的样品与第一抗体结合；
[0052](4)取出载有样品的镍网，用移液器依次滴加含有2质量％脱脂奶粉和0.5体积％Tween 20的PBS缓冲液(50 μ L)、PBS缓冲液(50 μ L)，镍网为多孔网，直径大约有4_5mm，滴加后样品覆盖在镍网的整个表面。
[0053](5)将金标记的第二抗体(以第一抗体为抗原得到的羊源抗体)1:20(体积比)稀释，得到稀释液，将载有样品的镍网与含有第二抗体的所述稀释液在室温下接触2小时，使已经结合在样品上的第一抗体与第二抗体结合；
[0054](6)将第(5)步骤得到的吸附有样品的镍网依次用TBS-Tween 20 (用量50 μ L)，TBS(用量50 μ L)洗涤，最后用去离子水洗涤(用量50yL)4次；
[0055](7)将镍网上的样品风干，将镍网装上样品杆使用透射电子显微镜(TEM)在60/80kV的加速电压下观察橡胶颗粒。
[0056]所述第一抗体可以是，例如，抗SRPP抗体(小橡胶粒子蛋白抗体，鼠源)。所述第二抗体是第二抗体为第一抗体的抗体，例如，以第一抗体