猪伪狂犬病毒gG的ELISA检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体地说，涉及一种猪伪狂犬病毒gG的ELISA检测试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病（Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV)引起 的一种以发热、奇痒（猪除外）和脑脊髓炎为主要症状的急性传染病，常感染猪、牛、羊、鼠 等，猪是该病毒的最主要宿主，其主要引起母猪繁殖障碍，表现为流产、死胎、木乃伊胎等； 新生仔猪发生感染时死亡率可达100%。该病是极难防疫的自然疫源性疾病，因其传播速 度快、死亡率高、流行范围广、传播途径多、病原体在动物体内持续感染，国际动物卫生组织 (OIE)将其列为二类传染病。我国现有31个省市发生过该病，给畜牧业造成了严重的经济 损失。
[0003] 猪伪狂犬基因缺失标记疫苗及配套鉴别诊断试剂盒的应用是净化根除该病的有 效途径。目前，我国使用基因缺失疫苗主要为缺失gE基因的Bartha-k61株活疫苗。此外， 国内自主研发的gG缺失株疫苗也已逐渐扩大市场份额，该疫苗尚无配套的鉴别诊断试剂 盒，疫苗免疫后无法用市售的检测试剂盒区分野毒感染还是疫苗免疫的猪群，因此亟需能 够区分疫苗免疫和野毒感染的鉴别诊断试剂盒。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病毒gG的 ELISA检测试剂盒。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0006] -种猪伪狂犬病毒gG的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包含包被有猪伪狂犬病毒 gG蛋白重组抗原的酶标板；
[0007] 所述gG蛋白重组抗原的制备方法如下：以gG蛋白编码基因为模板，利用引物对扩 增得到gG蛋白基因片段，构建重组表达载体，通过原核系统表达gG蛋白重组抗原；
[0008] 所述引物对包括：
[0009] 上游引物：ATGAATTCAGAGAGGCCCCTCGGGA ;
[0010] 下游引物：TAAAGCTTGGCCGCGGGCGAGCCCAC。
[0011] 进一步地，将所述重组表达载体转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，加 IPTG进行诱 导表达；将表达产物通过His-Tag镍柱亲和层析法纯化后，获得纯化的gG蛋白重组抗原。
[0012] 作为优选，所述gG蛋白重组抗原的包被量为0.1 -Iug/孔。
[0013] 更进一步地，所述包被有猪伪狂犬病毒gG蛋白重组抗原的酶标板的制备方法包 括如下步骤：
[0014] 1)将gG蛋白重组抗原用0. 05M pH9. 6的碳酸钠缓冲液稀释gG蛋白重组抗原，加 入酶标板孔中，包被量为〇. I-Iug/孔；
[0015] 2)将酶标板用封板膜覆盖，置于37°C下30分钟，然后转至4°C孵育不低于12h ;
[0016] 3)弃去酶标板孔内液体，向板孔中加入孔洗涤液，静置3分钟，重复3~5次；每 次洗涤时弃去孔内液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干；
[0017] 4)用含0. 5-4% BSA、2 % -8 %新牛血清的0.0 lM pH7. 4的磷酸盐缓冲液封闭酶标 板；
[0018] 5)将酶标板置于37°C下lh，孵育后将孔内液体弃去，在吸水纸上拍干；
[0019] 6)向酶标板板孔加入含5% -20 %蔗糖的0.0 lM pH7. 4的磷酸盐缓冲液室温孵育 3-5h，弃去孔内液体，自然晾干后，用加入干燥剂的包装袋抽真空密封保存。
[0020] 进一步地，所述试剂盒包含酶标抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的山 羊抗猪IgG。所述酶标抗体用样品稀释液作1 : 25000倍稀释，分装为25ml/瓶。
[0021] 进一步地，所述试剂盒还包括：样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血 清、底物显色液A、B和终止液。
[0022] 更进一步地，所述阳性对照血清为gG蛋白重组抗原免疫猪后，采集含有gG抗体的 猪血清。
[0023] 进一步地，所述样品稀释液和洗涤液中含有Pr〇Clin300作为防腐剂。
[0024] 所述阴性对照血清为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪血清。
[0025] 具体地，所述样品稀释液、洗涤液、底物显色液A、B和终止液的成分及含量如下：
[0026] 样品稀释液：称取 NaCl 8. 0g，KCl 0· 2g，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，BSA I. 0g， ProClin300 1.0 ml加蒸馏水900ml溶解，加蒸馏水定容至1000ml，分装为40ml/瓶。
[0027] 10倍浓缩洗涤液（0.1 M pH7. 4磷酸盐缓冲液）：称取NaCl 80g，KCl 2. 0g， Na2HPO4 · 12H20 29g，ProClin300 1.0 ml 加蒸馏水 900ml 溶解，再加入 Tween-20 5ml，加蒸 馏水定容至1000ml，分装为60ml/瓶。使用时，用蒸馏水10倍稀释后即可使用。
[0028] 底物显色A液：醋酸钠13. 6g，柠檬酸I. 6g，30 %双氧水0· 3ml，蒸馏水加至500ml， 分装为15ml/瓶。
[0029] 底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0. 2g，柠檬酸0. 95g，甘油50ml，取0. 15g TMB溶 于3mlDMS0中，蒸馏水加至500ml，分装为15ml/瓶。
[0030] 终止液：在891. 3ml蒸馏水中逐滴加入浓硫酸（98% ) 108. 7ml，即得2mol/L的 氏304的水溶液，混匀后分装为15ml/瓶，室温保存。
[0031] 本发明还进一步提供了所述试剂盒在检测猪血清中gG抗体方面的应用。
[0032] 所述应用具体为：
[0033] 1)从试剂盒中取出酶标板（已包被gG蛋白重组抗原的96孔酶标板），用样品稀 释液将待检血清样本40倍稀释（例如：5ul的样品加入195ul样本稀释液）。用移液器吸 取IOOul混合液至酶标板中，同时设置阳性对照血清及阴性对照血清各两孔，每孔IOOul ;
[0034] 2)在37°C条件下孵育60分钟；
[0035] 3)弃去孔内液体，向孔板中加入大约300ul/孔洗涤液（10倍浓缩液用蒸馏水稀释 为1倍工作液），静置3分钟，重复3-5次。每次洗涤时都应弃去孔内液体，最后一次洗涤弃 去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干；
[0036] 4)每孔加入IOOul酶标抗体；
[0037] 5)在37°C条件下孵育30分钟；
[0038] 6)重复步骤3);
[0039] 7)每孔加入底物显色液A和底物显色液B各50ul，轻微震荡混匀，避免孔内液体 溢出；
[0040] 8)在37°C条件下孵育15分钟；
[0041] 9)每孔加入50ul终止液，使反应终止；
[0042] 10)测量并记录被检样品和对照的OD值（450nm)。
[0043] 本发明试剂盒判定标准：阴性对照的平均值OD45ta小于0. 25,阳性对照的平均值 大于I. 0试验方能有效。S =样品0D4Mnni值，P =阳性对照的OD 4Μηηι平均值，
[0044] 如果S/P值大于0. 5,样品应判定为猪伪狂犬病毒gG抗体阳性。如果S/P值小于 或等于0. 5,但大于0. 4,样品应重测。如试验结果不变，应间隔一定时间后重新采样检测。 如果S/P值小于0. 5,样品应判定为猪伪狂犬病毒gG抗体阴性。如果试验无效，试验操作可 能有误，试验应重做。
[0045] 本发明的有益效果在于：
[0046] 本发明应用原核系统表达猪伪狂犬病毒gG蛋白重组抗原，包被酶标板制备ELISA 检测试剂盒，可区分gG基因缺失疫苗株免疫与野毒感染的抗体检测，可为gG缺失疫苗株提 供鉴别诊断技术。该方法具有敏感性高、特异性强的特点，且方法操作简单、检测时间短，2 小时内即可出判定结果，为净化根除伪狂犬病提供有力保障。
【具体实施方式】
[0047] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0048] 实施例1 gG蛋白重组抗原的制备
[0049] 1)提取猪伪狂犬病毒（PRV)基因组，根据GenBank上发表的猪伪狂犬病毒中国流 行株基因序列，针对gG蛋白编码基因的主要抗原位点区域设计扩增引物：
[0050] 上游引物：ATGAATTCAGAGAGGCCCCTCGGGA ;
[0051] 下游引物：TAAAGCTTGGCCGCGGGCGAGCCCAC。
[0052] 2)以PRV基因组为模板，根据上述引物扩增gG蛋白基因片段，将gG基因片段克隆 到T载体上，然后再将基因插入克隆载体pET-32a，构建重组表达载体，命名为pET32a-gG。
[0053] 3)将构建的pET32a_gG重组表达载体转化入大肠杆菌Rosetta (DE3)中，加 IPTG 进行诱导表达。
[0054] 4)将表达产物通过His-Tag镍柱亲和层析法纯化后，获得纯化的gG蛋白重组抗 原。
[0055] 实施例2包被gG蛋白重组抗原的酶标板的制备
[0056] 1)将实施例1得到的纯化后的gG蛋白重组抗原，用0. 05M pH9. 6碳酸钠缓冲 液稀释重组抗原，稀释终浓度为5. 6ug/ml，吸取稀释后的重组抗原加入酶标板孔中，每孔 100ul，即包被量为0. 56ug/孔。
[0057] 2)包被条件：将酶标板用封板膜覆盖，置于37°C 30分钟，然后转至4°C过夜孵育 (不低于12h)。
[0058] 3)弃去酶标板孔内液体，然后向板孔中加入大约300ul/孔洗涤液（10倍浓缩液用 蒸馏水10倍稀释为工作液），静置3分钟，重复3-5次。每次洗涤时都应弃去孔内液体，最 后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干。
[0059] 4)封闭：用含2% BSA(质量浓度）、5%新牛血清（体积浓度）的0· OlM ρΗ7· 4的 磷酸盐缓冲液封闭酶标板，每孔IOOul。
[0060] 5)封闭条件：将上述加入封闭液的酶标板置于37°C lh，孵育后将孔内液体弃去， 在吸水纸上拍干。
[0061] 6)将酶标板孔加入含5%蔗糖（质量浓度）的0.0 lM pH7. 4的磷酸盐缓冲液室温 孵育3h，弃去孔内液体，自然晾干后，酶标板用加入干燥剂的包装袋抽真空密封保存。
[0062] 实施例3猪伪狂犬病毒gG的ELISA检测试剂盒的制备
[0063] 1、材料：
[0064] 除实施例2制备的包被gG蛋白重组抗原的酶标板外，试剂盒还包括样品稀释液、 10倍浓缩洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、B、酶标抗体，终止液。
[0065] 2、制备方法
[0066] 1)样品稀释液制备：称取 NaCl 8. 0g，KCl 0· 2g，Na2HPO4 · 12Η202· 9g，BSA I. 0g， ProClin300 1.0 ml加蒸馏水900ml溶解，加蒸馏水定容至1000ml，分装为40ml/瓶。
[0067] 2)10倍浓缩洗涤液（0.说？!17.4磷酸盐缓冲液）：称取似(：18(^，1((：12.0 8， Na2HPO4 · 12H20 29g，ProClin300 Iml 加蒸馏水 900ml 溶解，再加入 Tween-20 5ml，加蒸馏 水定容至l〇〇〇ml，分装为60ml/瓶。
[0068] 3)阴性对照血清制备：采集未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪血清，以上述样品稀 释液作20倍稀释，分装Iml/瓶。
[0069] 4)阳性对照