一种检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及芯片检测技术领域，具体涉及一种检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒。
【背景技术】
[0002] 我国是胃癌的高发区，发病率高达40/10万，仅次于肺癌，已经跃居中国癌症发病 率的第二位。在中国，每年新增胃癌患者达40万人；占到全世界发病人数的42% ;患病率和 死亡率均是世界平均水平的两倍多；近5年来19岁至35岁青年人胃癌的发病率比30年前 翻了一番。在世界范围内，胃癌也是最为常见的癌症之一，具有很高的死亡率。因此，对胃 癌的诊断与治疗在医疗领域是一个重大的工程。目前在胃癌的综合治疗方案中，手术占据 主导地位，早期胃癌手术5年后的生存率可达95%，可见胃癌的早前诊断对胃癌的治疗及其 重要。然而，在中国对胃癌的早期诊断，并及时进行手术治疗所占的比例非常低，尽管中日 胃癌人群发病率相当，但日本的早期胃癌发现率和手术率均已超过50%，中国该两项数据 则均低于5%。由此可见，在中国对胃癌的早期诊断并及时进行手术治疗对胃癌的防治工程 具有重大意义。大量的研究已经证实，在胃癌患者的早期，血清中有数种分子水平已经发生 了明显的变化，比如：CEA、CA199，CA72-4，PGI/PGII明显上升。因此，通过对血清中这些分 子水平的定量检查可以作为胃癌预测的一个有效手段。为了增加预测的敏感性和特异性， 将多个指标联合起来诊断是一个很好的办法。比如联合采用CEA、CA242、CA72-4可以提高 预测的敏感性和特异性。原来的芯片上的指标都是比较经典的指标，新近又有两个指标通 过临床验证具有很好的诊断价值，比如：PGI、PGII。添加这两个指标更具有临床价值。蛋 白芯片技术，可以在一个极小的微阵列内同时检测上百个指标，具有检测速度快、样本用量 少、灵敏度高、稳定性好等优点，是用来开发这种多指标同时检测的最优技术选择。
[0003] 胃癌的早期的发现率低，主要与早期胃癌的症状不明显以及目前市场上缺乏有效 的检测手段有关。目前，临床上胃癌的确诊都要通过胃镜来验证。胃镜检查，不仅费用高， 而且对患者来讲是及其痛苦的。因此，开发其它有效的检测手段是及其必要的。血清学检 测已经成为临床诊断的一个常规手段。而且，大量的研究证实，在早期的胃癌患者体内相应 的肿瘤标志物的水平明显上升。比如以下肿瘤标志物：
所有的这些指标已经成为临床检测项目。然而，大量的回顾性研究已经发现，单个指标 的肿瘤标志物对肿瘤的敏感性和特异性都是很低的，比如：通过多个指标的联合检测可以 大大提高肿瘤检测的敏感性和特异性。因此，开发一种可以同时检测多个指标的方法，避免 传统单个指标检测方法样本使用量大，检测时间长的弊端是非常必要的。蛋白芯片可以在 一个小的方阵内同时检测多个指标，因此为实现本目标提供了一个极佳的技术支持。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种高通量、高灵敏度、高特异性和低成本的早期胃癌检 测试剂盒，具体为采用抗体芯片技术，能够同时检测5个胃癌肿瘤标志物，克服了现有技术 操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量 少、能在普通实验室推广和规模化等优点。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 一种检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒，所述试剂盒由固相载体、洗涤液、稀释液、检测 抗体、荧光素-链霉亲和素溶液、样本处理液组成，其中，固相载体上固定多种胃癌标志物 相关特异性抗体，所选特异性抗体是从35种肿瘤标志物相关抗体中筛选得到；所述35种 胃癌肿瘤标志物为：CEA，CA242, IL-lbeta，IL-6, CA72-4, IL-11，IL-8, IL-18, PGI，PGII， MCP1, MCP3, MCP4, CK19, VEGF, NGAL, RANTES, MMP1, MMP7, MMP9, TIMP-1, IGFBP2, TNF-alpha, GMCSF, VDBP, TTR, AEG-1, ADAM10, ADAM17, Nardilysin, ProApoAl, ApoAl, HCG beta, CA50, CA199〇
[0006] 作为优选实施方式，所述固相载体上固定的多种胃癌标志物相关特异性抗体选自 以下32种胃癌标志物相关抗体中的多种或全部；CEA，CA242, IL-lbeta，IL-6, CA72-4， IL-8, IL-18, PGI, PGII, MCP1, MCP3, MCP4, CK19, VEGF, NGAL, RANTES, MMP1, MMP7, MMP9, TIMP-1, IGFBP2, TNF-alpha, GMCSF, VDBP, TTR, ADAM10, ADAM17, Nardilysin, ProApoAl, ApoAl，CA50, CA199。
[0007] 更优选地，所述固相载体上固定5种胃癌标志物相关特异性抗体，5种胃癌标志物 相关特异性抗体为CEA、CA199，CA72-4, PGI，PGII蛋白之抗体。
[0008] 优选地，所述固相载体由玻片，软质硅胶垫，硬质框架，U形框夹形成反应槽，硬质 框架划分为2X8或16X4个小孔，形成16或64孔框架。软质硅胶垫尺寸对应于所述硬质框 架以及标准玻片，硬质框架的每个小格形成一个小的反应槽，各个小的反应槽里的标准玻 片结合有相应浓度的特异性抗体。
[0009] 优选地，所述胃癌标志物的特异性抗体通过全自动点样仪完成点样操作，将特异 性抗体固定在载体上。
[0010] 更优选地，所述全自动点样仪点样操作，包括以下步骤： 1)特异性抗体与含有1. 4至2 %酪蛋白的pH7. 4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物。
[0011] 2)于抗体混合物中将每个抗体含量以0. 01至2ng固定于所述点样孔，每个抗体设 置2至4个重复孔。
[0012] 3)抗体芯片点阵排布于玻片，玻片每平方厘米点5至35种特异性抗体。各特异性 抗体的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的抗体芯片排布阵列，通过控制全 自动点样仪，制备出所需要的中间产品。
[0013] 所述样本处理液，用于裂解细胞沉淀物，包含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲 液。所用样本可为血浆，血清，尿液，细胞培养物，组织。
[0014] 本发明所述检测早期胃癌的芯片试剂盒，通过改良的夹心酶联免疫吸附法测定胃 癌肿瘤标志物，所述的特异性抗体与样品中的目标抗原结合，经过筛选的检测抗体与目标 抗原的另一区域结合形成稳定的化合物。本发明试剂盒能同时检测5至35个胃癌相关抗 原蛋白。其中组合后的抗体芯片比采用单个肿瘤标志物的检测效果好。
[0015] 所述玻片还包括阳性对照孔和阴性对照孔；阳性对照孔为对应特异性抗体的具有 相应浓度的生物素化IgG抗体，每个反应的生物素化的IgG抗体的浓度一致，以便于标准化 检测；阴性对照孔为具有相应浓度的生物素化的无关抗体，每个反应的生物素化的无关抗 体的浓度一致，以便于标准化检测。
[0016] 本发明所述试剂盒，利用荧光素作为检测信号，通过比较未知样品和标准样本的 信号来确定样品中的目标抗原的浓度。
[0017] 本发明所述试剂盒，利用Gen印ix Pro 6. 1软件获取芯片上所有点的信号强度，利 用自行开发的电子表格版的分析软件计算每个蛋白的表达水平和标准曲线，利用阳性对照 信号标准化，背景阈值设置对照组的平均强度加上2倍标准偏差（SD)进行统计，表达水平 高于背景加上2xSD的蛋白用于校正的T检验分析。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明采用的抗体芯片是多个夹心ELISA法同时进行定量检测的系统，它结合了 ELISA法高特异性和灵敏度及芯片高通量的优势。通过在玻片上固定多个特异性捕获抗体， 一次实验可定量检测至少上千个蛋白，检测样品体积仅需50~100微升。利用荧光素作为检 测信号，通过比较未知样品和参考值的信号来确定样品中的未知因子的含量，其结果具有 一致性和可靠性且节省时间和样品量。
[0019] 本发明同时采用了玻片式抗体芯片平台的优势。玻片式芯片是抗体预先固定在标 准大小的玻片上，并用16或64孔的框架形成的多通量的芯片。玻片式芯片与膜芯片相比 有以下优点：首先多个阵列在同一个标准大小玻璃片上，通量大大增加，其次，所需样品量 更少，约是膜芯片的十分之一。最后，可应用于自动化操作，方便技术员一天完成几百个芯 片的检测工作。玻片式芯片制作成本较低，价格比膜芯片便宜约20%，适合于膜芯片的样品 都可以用于玻片式芯片。玻片式芯片激光扫描仪来检测突光信号，几乎相同原理的扫描仪 都可以使用。玻片式芯片荧光信号可维持数月，适用于蛋白浓度的定量分析。
【附图说明】
[0020] 图1固相载体结构图。
[0021] 图2. 35种胃癌肿瘤标志物相应抗体点样示意图。
[0022] 图3. 35种胃癌肿瘤标志物相应抗体包被芯片的检测结果。
[0023] 图 4.CEA，CA199，PGI，PGII，CA72-4 相应抗体点样示意图。
[0024] 图5.试剂盒CEA抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性比较。
[0025] 图6.试剂盒CA72-4抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性比较。
[0026] 图7.试剂盒CA199抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性比