针对蜂蜜中mrjp1抗体对的制备方法、检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及蜂蜜成分含量的测定技术，尤其设及一种蜂蜜所含的由蜜蜂封后分泌 的内源性蜂王浆主蛋白MRJP1特异性双抗体的制备方法，及用双抗体检测渗假蜂蜜的双抗 体夹屯、方法等。
【背景技术】
[0002] 蜂蜜是蜜蜂工蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，在巢脾中 经充分酿造形成的天然甜物质。我国是蜂蜜生产和出口大国，2012年全国产量达到45.16万 吨，占世界蜂蜜总产量的1/4;2013年出口蜂蜜12.5万吨，占世界蜂蜜贸易量的1/4。根据中 华人民共和国供销合作行业标准GH/T 18796-2012《蜂蜜》对蜂蜜真实性的描述，"蜂蜜中不 得添加任何当前明确或不明确的添加物；如果在蜂蜜中添加其它物质，不应W '蜂蜜'或' 蜜'作为产品名称或名称主词;采用我国国家标准GB/T 18932.1(2012)《蜂蜜中碳-4植物 糖含量测定方法稳定碳同位素比率法》方法检测，蜂蜜中的碳-4植物糖含量不得大于7。" 由于蜂蜜渗假成本低廉，检测困难，不法商贩容易牟利，已严重扰乱蜂蜜市场秩序，导致产 品信任度严重下降，导致行业整体价格和效益下降。目前市场上最常见的蜂蜜渗假方式是 加入果葡糖浆、玉米糖浆、甜菜糖浆等，尤其是用大米糖浆勾兑的假蜂蜜，其理化指标和风 味完全可W通过欧盟标准，难W检测，严重影响了我国国际贸易声誉。近年来，蜂蜜市场鱼 龙混杂，渗假造假的事件不断被曝出。2015年3月，在十二届全国人大=次会议上，10名全国 人大代表提交了 "严厉打击假劣蜂产品的建议"。2015年7月，国家食品药品监督管理总局在 其官网正式作出回应:现行蜂蜜国家标准无法鉴别蜂蜜的真假，将积极推动蜂蜜食品安全 国家标准的修订和蜂蜜渗假补充检验方法的建立。
[0003] 为打击渗假蜂蜜，多年来国内外开展了大量W渗假物质：来自于甘薦和玉米等碳 四植物薦糖和高果糖浆，来源于碳=植物的大米糖浆为指标的检测方法研究。由于蜜蜂采 集的花粉来自于碳=植物，与甘薦和玉米运两类植物产生的糖中C13同位素的比例不一样。 理论上可用碳四植物糖的同位素检测方法确定蜂蜜的"真假"。但不同的蜂蜜差异实在太 大，C13同位素偏移的范围也很大，很难准确判断真假。有了碳四检测法后，一些不良商家便 开始改为添加碳=糖，常见就是用碳=植物源的大米糖浆和甜菜糖浆，如果在蜂蜜中渗入 大米糖浆，碳四检测方法就无能为力了。随后发明了用高效液相色谱质谱联用化C-MS)仪来 检测大米糖浆。但如果把大米糖浆水解转化成葡萄糖和果糖，即便同时使用碳四检测和LC-MS仪检测，都无法辨别是否渗假。
[0004] 我国曾先后颁布了GB/T 18932.22-2003《蜂蜜中果糖、葡萄糖、薦糖、麦芽糖含量 的测定方法液相色谱示差折光检测法》、GB/T 18932.16-2003《蜂蜜中淀粉酶值的测定方 法分光光度法》、GB/T18932.16-2003《蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法》等多项 检测方法标准。国内外已报道的检测渗假蜂蜜技术有：（1)液相色谱-同位素比率质谱联用 (LC-IRMS):通过对蜂蜜样品中的薦糖、葡萄糖、果糖和蛋白质的S13C进行分析，发现AS13C [果糖-葡萄糖]、A S13C[果糖-薦糖]、A S13C[葡萄糖-薦糖]可W指示渗假蜂蜜中的外源糖 类，有效识别出C3糖（甜菜糖）和C4糖（薦糖、薦糖糖浆、高果玉米糖浆KCabanero et al， 2006)。（2)液相色谱/元素分析-同位素比值质谱联用法化(：/64-11?15):发现纯正蜂蜜样品 A513C[蛋白质-蜂蜜]> -0.95°/〇〇，A5l3C[果糖-葡萄糖]在-0.64%〇~0.53%〇之间（费晓 庆等，2011)。（3)光谱技术鉴别：陈兰珍等采用近红外光谱分析(NIR)与DPLS化学计量学结 合的方法建立了5组数学模型，WC4植物糖检测结果为判定依据，进行了蜂蜜样本识别（陈 兰珍等，2008) "Kelly等利用用户傅里叶变换-拉曼光谱法，并结合SIMCA分类法检测了渗 入C3甜菜糖浆和C4高果玉米糖浆的蜂蜜样品，进行了蜂蜜真伪鉴定，并用化S法预测了渗假 水平化e 1 Iy等，2006)。（4)核磁共振法(NMR) :Bedel 1 i等利用一维和二维核磁共振法，结 合多变量统计分析，检测蜂蜜中渗入不同浓度的糖浆(Bertelli et al, 2010) eSpiteri等 用IH-NMR对采自全球范围内的800余个蜂蜜样品进行了分析，在200余份样品中发现了糖浆 成分(Spiteri et al, 2015)。（4)蜂蜜元素组成分析:吴招斌等采用电感禪合等离子体质 谱法（ICP-MS)结合主成分分析和判别分析，测定了洋槐蜜、葵花蜜和油菜蜜中20种矿物质 元素含量，用筛选出1旨、5'、8曰、化、56、化和化巧巾矿物质元素建立判别模型，利用该模型对 蜂蜜品种作了鉴别(吴招斌等，2015)。桂茜姜等采用ICP-MS测定了大米糖浆和纯正蜂蜜中 神的含量，发现纯蜂蜜与大米糖浆中的神元素含量相差10倍W上，纯蜂蜜中神含量均低于 15iig/kg，确定蜂蜜中神含量超过15iig/kg为大米糖浆渗假蜂蜜(桂茜姜等，2014)。但由于 蜜蜂中的渗假方法和渗假成分多，用检测外源成分鉴别假蜂蜜需要同时采用多种方法，单 一方法很难凑效。同时，W上各种方法需要采用昂贵的精密仪器，检测成本很高。我国W往 公布的发明专利申请中，基本涵盖了 W上论文报道所述的液相色谱、质谱、近红外光谱测定 渗假外源糖类的方法。其中胡福良等申请的发明专利"一种蜂蜜真伪的鉴别方法及应用" (申请号:201110067242.9)报道了用分光光度计检测蜂蜜有无0-葡萄糖巧酶活力来鉴别渗 假蜂蜜的方法，但迄今未见实际应用。
[0005]为此，国外科学家开始探索W蜂蜜内源成分王浆主蛋白【Major Royal Jelly Proteins (MRJPs)CLensky and Rakover 1983, Comp Biochem Physiol. 75: 607-615)] 为指标的渗假蜂蜜检测方法。王浆主蛋白属于水溶性蛋白，是蜜蜂工蜂头部王浆腺蜂蜜物 蜂王浆的主要活性成分，约占蜂王浆总蛋白的46%-89% (Tomoda等.1977，J Apic Res. 16: 125-130; Takenaka and Echigo 1983, Nippon Nogeikagaku Kaishi. 57: 1203-1209)。目前已通过对西方蜜蜂基因组研究确定，MRJPs家族有9个成员，即MRJPl~MRJP9 (Drapeau et al. 2006,Genome Research ,16: 1385-1394)，其分子量范围在25~87 kDa。 在MR肝S家族中，分子量为55-57的MRJPl(或者A化umin-1)是含量最高的蛋白质，约占水溶 性蛋白（MR肝S家族）的48%(化nes and Simuth. 1992，J. Apicult. Res. 31: 22-26)，是 反映蜂王浆质量和新鲜度的典型生物标记物。斯洛伐克学者BiIikova和化zef (BiUkova 和Jozef. 2010. J. Agric. Food 化em. 2010，58，8776-8781)已发现蜂蜜含0.05-0.79%的蛋白质，蛋白质主要为蜂王浆主蛋白MR肝S，其中WMR肝1含量最高，可作为蜂蜜质 量的检测指标。为此他们设计了检测蜂蜜中MR肝1含量的间接法化ISA定量分析方法。其主 要方法原理是：W从蜂王浆中分离纯化的MR肝1全蛋白为抗原免疫大白兔，制备成MR肝1多 克隆抗体；WMR肝1蛋白为标准物，用间接化ISA法建立吸光度和MRJPl标准蛋白间的直线回 归方程。最后，W此MRJPl多克隆抗体为一抗，用间接化ISA法定量检测了蜂蜜中的MR肝1含 量。但由于MR肝S成员间具有高度的同源性，用MR肝1全蛋白建立的抗体并不具备特异性，检 测得到的结果是所有王浆主蛋白的总含量。根据我们研究，W在大肠杆菌种中表达的 MR肝7、MRJP1重组全蛋白免疫大白兔所制备的抗体为一抗Western blot法检测蜂王浆，可 显示有MRJPs家族蛋白成员的所印迹。因此，BiUkova和化zef所报道的方法存在缺陷，不具 备专一性检测MRJPl的特性。
[0006] 申请人曾经开发成功用MR肝1特异性抗体检测蜂王浆中MR肝1含量判断蜂王浆新 鲜度的间接法化ISA(发明专利CN201210576152.7)，但若需要判别真假蜂蜜尚需克服灵敏 性和特异性等问题。
[0007] 综上所述，目前尚无检测蜂蜜质量或者渗假的快速低成本办法。
【发明内容】
[000引本发明公开了 一种针对蜂蜜中内源MR肝1抗体对的制备方法、检测方法及试剂盒。 [0009] -种针对蜂蜜中内源MRJPl抗体对的制备方法，所述的MRJPl的特异性多肤M4的氨 基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQ ID NO: 1所示;所