均值(n=3)为纵坐标，MR肝1标准蛋白溶液浓度为横坐标，得 到标准曲线（图4) :y=0.0872X+0.2987，R 2=0.99741。
[0046] .渗假蜂蜜的化ISA检测 (1)蜂蜜样品预处理 取纯洋槐蜂蜜样品用地2〇W质量比1:1稀释，4°C抽提过夜，然后12000巧m、4 °C离屯、 30 min,取上清，得蜂蜜水提液。
[0047] (2 化LISA 分析 夹屯屯LISA方法的具体操作步骤如下： a. 包被捕获抗体:将MRJPl多克隆抗体SP-I用CBSWl :10000稀释，WlOO yL/孔加入 96孔酶标板，37 °C解育2 h; b. 封闭:每孔加入200化5%脱脂奶粉，4°C过夜； C.洗板:弃尽包被液，每孔加入200 iiL PBST，置于平板摇床上洗涂5次，每次5 min; d.加入抗原:用PBS将蜂蜜水提液稀释至标准曲线检测范围，WlOO iiL/孔加入96孔酶 标板，4 °C过夜； e. 加入酶标抗体：用PBS将皿P-SP-2抗体W1:1000稀释，100化/孔加入96孔酶标板， 37 °C 反应2 h; f. 洗板:弃尽包被液，每孔加入20化L PBST，置于平板摇床上洗涂5次，每次5 min; g. 显色:每孔加入200 yL TMB显色液(按试剂盒说明书操作），37 °C避光反应15 min; h. 终止显色:每孔加入50化终止液； i. 读数:立即置于酶标仪上，读取450皿、630皿处的吸光值。
[004引 将洋槐蜜和玉米糖浆按比例混合，用夹屯、法检测450 nm和630 nm处吸光值，将样品 A450-A630代入标准曲线，计算得出渗假蜂蜜中MRJPl含量，W纯洋槐蜜的计算值作为理论值 对照，结果如表4所示。当样品理论值为0 mg/g时，在标准曲线检测范围外，误差为100%。由 表4可知，采用夹屯媒检测蜂蜜中MR肝1含量，并W此推测渗假程度具有可行性。
[0049] 实施例7:根据纯蜂蜜的MR肝1含量范围判别商品蜂蜜真伪 1.各种纯蜂蜜MRJPs含量分析 (1)蜂蜜样品预处理 取6种已知蜜源的蜂蜜样品洋槐蜜、冬青蜜、百花蜜、狼牙刺蜜、批把蜜、要花蜜，分别用 地2〇W质量比1:1稀释，4°C抽提过夜，然后12000巧m、4 °C离屯、30 min,取上清，得蜂蜜水 提液。
[0050] 分析 分别用CBS和PBS稀释蜂蜜水提液至标准曲线检测范围，按如下夹屯屯LISA法步骤操作： a. 包被捕获抗体:将MRJPl多克隆抗体SP-I用CBSW 1:10000稀释，WlOO 化/well加 入96孔酶标板，37 °C解育2 h; b. 封闭:每孔加入200化5%脱脂奶粉，4°C过夜； C.洗板:弃尽包被液，每孔加入200 iiL PBST，置于平板摇床上洗涂5次，每次5 min; d. 加入抗原:用PBS将蜂蜜水提液稀释至标准曲线检测范围，WlOO化/well加入96孔 酶标板，4 °C过夜； e. 加入酶标抗体:用PBS将2.2.1.4得到的HRP-SP-2抗体W1:1000稀释，100化/well 加入96孔酶标板，37 °C反应2 h; f. 洗板:弃尽包被液，每孔加入20化L PBST，置于平板摇床上洗涂5次，每次5 min; g. 显色:每孔加入200 yL TMB显色液(按试剂盒说明书操作），37 °C避光反应15 min; h. 终止显色:每孔加入50化终止液； i. 读数:立即置于酶标仪上，读取450皿、630皿处的吸光值。
[0051 ] (3)纯蜂蜜样品MR肝S含量测定 将用夹屯、法检测各种蜂蜜样品450 nm处的得到吸光度代入标准曲线：y = 0.084X+ 0.2972,计算得到蜂蜜样品中MRJPl含量。结果(表5)表明，不同蜜源的MRJPl含量存在差别， 但MRJPl含量一般大于0.50 mg/g，多数蜂蜜的MRJPl含量在1.00 mg/gW上。
[0化2] 2.商品蜂蜜真伪 将来自澳口市场的未知的蜜源蜂蜜样品（编号W1、W2、W3、W4、W5、C12、C13、C14、C15、 C16)用d出OW质量比1:1稀释，4 °C抽提过夜，然后12000巧m、4 °C离屯、30 min,取上清液， 用夹屯、化ISA法检测蜜源未知的商品蜂蜜样品的吸光度，代入标准曲线：y = 0.084X+ 0.2972，计算得到各样品中MRJPl含量，结果如表6所示。因样品化、胖2、胖5、(：12、(：16的11?肝1 含量大于1 mg/g，可判定为真蜂蜜；样品胖3、胖4、(：13、(：15的11?肝1含量低于0.5 111旨/旨，可判 定为渗假蜂蜜。
[0053]在已知本发明公开的抗体对的情况下，本领域技术人员可W根据现有技术得到 ELISA试剂盒或者免疫层析试纸条等。
【主权项】
1. 一种针对蜂蜜中内源MRJP1抗体对的制备方法，其特征在于，所述的MRJP1的特异性 多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIH)，如SEQ ID NO: 1所示;所述的MRJP1的特异性多肽M5 的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQIDN0:2所示 ;然后免疫新西兰白兔。2. -种针对蜂蜜中内源MRJP1的免疫检测方法，其特征在于， 1)利用MRJP1特异性多克隆抗体SP-1为捕获抗体，MRJP1特异性多克隆抗体SP-2为检测 抗体，以免疫双抗夹心法测定待测蜂蜜中MRJP1含量； 所述的MRJP1特异性多克隆抗体SP-1通过利用MRJP1特异性多肽M4免疫新西兰白兔得 至丨J;所述的MRJP1特异性多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQ ID NO: 1所示； 所述的MRJP1特异性多克隆抗体SP-2通过利用MRJP1特异性多肽M5免疫新西兰白兔得 至丨J，所述的MRJP1特异性多肽M5的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQIDN0:2所示。3. 根据权利要求2所述的免疫检测方法，其特征在于，所述的免疫双抗夹心法为ELISA 双抗夹心法，按以下步骤进行处理:包被捕获抗体SP-1，封闭，洗涤，加入抗原，加入酶标的 检测抗体HRP-SP-2，洗涤，加显色底物，加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450 nm-630 nm。4. 根据权利要求3所述的免疫检测方法，其特征在于，所述的抗原为待测蜂蜜或已知蜜 源的纯蜂蜜，通过比较待测蜂蜜和已知蜜源的纯蜂蜜的MRJP1的吸光值判断待测蜂蜜的质 量。5. 根据权利要求3所述的免疫检测方法，其特征在于，所述的抗原为已知的不同浓度的 MRJP1，绘制以MRJP1浓度为横坐标，以0D45Q-0D63Q为纵坐标的标准曲线，建立回归方程； 所述的抗原为待测蜂蜜时，将获得的吸光值，代入上述回归方程，从而得到待测蜂蜜中 MRJP1的含量。6. 根据权利要求5所述的免疫检测方法，其特征在于，通过比较待测蜂蜜和已知蜜源的 纯蜂蜜的MRJP1的含量判断待测蜂蜜的质量。7. 根据权利要求2所述的免疫检测方法，其特征在于，所述的MRJP1特异性多克隆抗体 SP-l、SP-2的效价均>1: 20000,酶标抗体HRP-SP-2的效价>1: 5000,以合成多肽M4、M5和 纯化的MRJP1为抗原，经ELISA测定。8. -种采用如权利要求2所述的免疫检测方法的试剂盒，其特征在于，主要包括MRJP1 特异性多克隆抗体SP-1、SP-2抗体对，其中以MRJP1特异性多克隆抗体SP-1为捕获抗体， MRJP1特异性多克隆抗体SP-2为检测抗体，以双抗夹心法测定待测蜂蜜中MRJP1含量。9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为ELISA或者免疫层析试 纸条试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种针对蜂蜜中MRJP1抗体对的制备方法、检测方法及试剂盒。所述的MRJP1的特异性多肽M4的氨基酸序列为IKEALPHVPIFD，如SEQ ID NO：1所示；所述的MRJP1的特异性多肽M5的氨基酸序列为SGEYDYKNNYPSDID，如SEQ ID NO：2所示；然后免疫新西兰白兔。ELISA双抗夹心法，按以下步骤进行处理：包被捕获抗体SP-1，封闭，洗涤，加入抗原，加入酶标的检测抗体HRP-SP-2，洗涤，加显色底物，加显色终止液，用酶标仪测定样品的吸光值450 nm-630 nm。所述的抗原为待测蜂蜜或已知蜜源的纯蜂蜜，通过比较待测蜂蜜和已知蜜源的纯蜂蜜的MRJP1的吸光值判断待测蜂蜜的质量。本发明为蜂蜜质量及掺假量检测提供了一种可靠的快速检测新方法，可用于蜂产品质量监管部门、加工贸易企业蜂蜜产品质量控制。
【IPC分类】C07K16/06, G01N33/543, C07K16/18, G01N33/68
【公开号】CN105693858
【申请号】CN201610146713
【发明人】沈立荣, 王一然, 谌迪, 张一帆, 沈苗宏, 辛晓璇
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年3月15日