检测非洲猪瘟病毒的pcr引物、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及用于检测非洲猪磕病毒(African swine fever virus,ASFV)的PCR引 物，还涉及所述PCR引物制备得到的试剂盒及其在非洲猪磕病毒检测中的应用，属于非洲猪 磕病毒的检测领域。
【背景技术】
[0002] 非洲猪磕(African swine fever,ASF)是由非洲猪磕病毒（African swine fever virus，ASFV)引起的家猪和野猪的烈性传染病，为世界动物卫生组织(OIE)规定必须申报的 一类动物疫病，给疫区国家造成了巨大的经济损失（Costard, S.，Mur，L.，Lubroth，J.， Sanchez-Vizcaino，J.M.，Pfeiffer，D.U.,2013.Epidemiology of African swine fever virus .Virus Res .173,191-197 JdASFV为一大的有囊膜的双链DNA病毒，属于非洲猪磕病 毒科（Asfarviridae)非洲猪磕病毒属（Asf ivirus)成员（Dixon ,L.K. ,Chapman ,D.A.， Netherton，C.L.，Upton，C.，2013.African swine fever virus replication and genomics.Virus 民es.173，3-14.)。
[0003] ASFV可引起感染家猪和欧洲野猪的出血热和高死亡率，而对非洲野猪，如疵猪 (warthogs)和非洲灌化野猪（bushpigs)则呈隐性感染（Denyer,M.S. ,Wilkinson，P.J.， 1998. African Swine Fever. IniEncyclopedia of Immunology .pp. 54-56.) dASFV还存在 于非洲纯缘婢，该婢是ASFV的自然宿主。
[0004] 经历了上世纪60年代、70年代和80年代从非洲大陆到欧洲和美国的几段长距离传 播之后，近30年^来，除了意大利的撒下岛，ASF局限于非洲地区。直到2007年，该病爆发于 格鲁吉亚（Rowlands,R.J.，Michaud，V.，Heath，L.，Hutchings，G. ,Oura,C.，Vosloo，W.， Dwarka,民.，Onashvili，T.，Albina，E.，Dixon，L.K.,2008.African swine fever virus isolate,Georgia，2007.Emerg.Infect.Dis.14,1870-1874.;Costard，S.，Mur，L.， Lubroth,J.，Sanchez-Vizcaino，J.M.，Pfeiffer，D.U.,2013.Epidemiology of African swine fever virus.Virus Res. 173,191-197.)，随后疫情迅速蔓延至整个高加索地区和 俄罗斯联邦、白俄罗斯和乌克兰，最终于2014年传到了欧盟（Gogin，A.，Gerasimov，V.， Malogolovkin，A.，Kolbasov，D.,2013.African swine fever in the North Caucasus region and the 民ussian Federation in years 2007-2012.Virus 民es.173，198-203.; OIE.2014.World Animal Health Information Database(WAHID).http://www.oie.int/ wahis_2/public/wahid.php/Diseaseinformation/Immsumma ry.;S自nchez-Vizcalno， J.M.，Mur，L.，Gomez-ViI Iamandos，J.C.，Carrasco，L.，2015. An update on the epidemiology and pathology of African swine fever.J.Comp.Pathol.152,9-21)。鉴 于ASF传播的各种已知风险因素及中国最近经济和国际贸易的不断扩张，对于该病传入世 界养猪第一大国中国的风险不容忽视。
[0005] 由于目前没有针对ASF的疫苗及有效的治疗手段，快速可靠的诊断对防控措施的 及时实施，阻止该毁灭性疾病的蔓延是至关重要的。此外，考虑到与其它猪传染病如猪磕 (CSF)的临床症状相似^及非特异性临床表现出现的可能性，对ASFV的早期和准确的检测 是快速决策的关键（Oura,C.A.，Edwards，L.，Batten，C.A.，2013.Virological diagnosis of African swine fever-comparative study of available tests.Virus 民es.l73， 150-158.) D对于病毒学检测，OIE推荐的方法包括病毒分离、焚光抗体实验(FAT)、常规PCR 和实时定量 PCR (焚光定量 PCR)(AgUero，M. ,Fern自ndez，J.，Romero，L ?，S^chez Mascaraque，C.，Arias，M.，S自nchez-VizcaIno，J.M.,2003.Highly sensitive PC民 assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples.J.Cl in.Microbiol.41,4431-4434.;King,D.P.，民eid，S.M.,Hutchings，G.H.， Grierson，S.S. ,Wilkinson，P.J. ,Dixon，L.K. ,Bastos，A.D. ,Drew,T.W.， 2003.Development of a TaqMan PC民 assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus.J.Virol.Methods 107,53-61; 0ura，C.A.L.，Arias，M.,2012.African swine fever. In:OIE Biological Standards Commission(ed)，0IE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals,7th ed.Office International des Epizooties,Paris,France,pp.1069-1082.;0ura，C.A.，Edwards，L.，Batten，C.A.,2013.Virological diagnosis of African swine fever-comparative study of available tests.Virus 民es.173，150-158.;S自 nchez-VizcaIno，J.M.，Mur，L.，Gomez-Villamandos，J.C.，Carrasco，L.,2015.An update on the epidemiology and pathology of African swine fever.J.Comp.Pathol.152,9-21.) D病毒分离被认为是ASF诊断的金标准，然而该方法耗时耗力，通常仅在参考实验室作 为验证性诊断方法（Oura,C.A.，Edwards，L.，Batten，C.A.，2013.Virological diagnosis of African swine fever-comparative study of available tests.Virus 民es.l73， 150-158.) dPCR方法因其具有很高的夷敏度和特异性，是目前应用最为广泛的检测手段，特 别适用于已不适合病毒分离的组织的检测dOIE推荐的PCR方法用于参考实验室的常规诊断 (Aguero，M.,Fern自ndez,J.，民omero，L.，S自nchez Mascaraque，C.,Arias，M.，S自nchez-VizcaIno，J.M.，2003.Highly sensitive PC民 assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples.J.Clin.Microbiol.41,4431-4434.; King，D.P.，民eid，S.M.，Hutchings，G.H.，Grierson，S.S.，Wilkinson，P.J.，Dixon，L.K.， Bastos，A.D.,Drew,T.W.,2003.Development of a TaqMan PC民 assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus.J.Virol.Methods 107,53-61.;Oura，C. A.L.,Arias，M.，2012. African swine fever.In:0IE Biological Standards Commission(ed),OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals,7th ed.Office International des EpizootieStPariSiF'rancetPp. 1069-1082. )D近年来建立的焚光定量PCR检测方法表现出 了较高的夷敏性（Fern自ndez-Pinero，J. ,Gallardo，C. ,Elizalde，M. ,Robles，A.，G6mez， C.,Bishop,民.，Heath，L.，Couacy-Hymann，E.，Fasina，F.0.，Pelayo，V.,Soler,A.,Arias, M.，2013.Molecular diagnosis of African swine fever by a new real-time PC民 using universal probe library. Transbound.Emerg.Dis.60，48 - 58.;Gallardo，C.， Nieto，民.，Soler，A.，Pelayo，V.，Fern自ndez-Pinero，J.，Markowska-Daniel，I.， Pridotkas，G.,Nurmoja，I.,Granta，民.，Simon，A.,Perez，C.,Mart In，E.,Fern自ndez - Pacheco，P.,Arias，M.，2015.Assessment of African swine fever diagnostic techniquesas a response to the epidemic outbreaks in Eas