专利名称：基于量子点技术的一种非洲猪瘟检测方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米技术领域的检测方法，具体说是一种基于量子点技术的一种非洲猪瘟检测方法。
背景技术：
免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还需要借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸、及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。作为一种操作简单、检测快速、结果可靠的组织样本中蛋白检测方法，免疫组化正越来越多的地应用于医学研究及临床诊断中。用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。但是，目前常用的荧光素多是有机染料，存在荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定的限制。量子点(QDs)特指半径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米颗粒，由于其具有发射光谱窄且具有尺寸“调谐”特性，用单个波长即可激发不同的量子点，荧光量子产率高， 稳定性好，很好的生物相容性等优点，在生物医药标识方面，量子点巨大的研究和应用价值逐步被看好。通过将量子点连接在抗原或者抗体上，形成量子点标记的抗原(抗体)复合物，借助于组织化学方法直接进行显色反应，可以显示细胞或组织中的化学成分，在荧光显微镜下可清晰看见细胞内或者组织中发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布及其含量。另外，量子点宽的吸收峰和窄的吸收峰使得在一个简单的系统中进行多色多通道分析检测成为可能。量子点基础上的免疫组化分析方法，具有以下有点光稳定性增加，高灵敏度，与现有化学发光比较灵敏度高或者相当；线性强，提高蛋白表达量；与现有的成像系统相容， 不用专用设备；节约实践和成本；多色检测，可以在同一个检测窗口观测到多个抗体的存在并决定他们的浓度，比单色检测降低成本。用量子点标记的免疫组化检测方法，可以大大加速并且提高检测的灵敏度和分析的准确度。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于基于量子点技术的一种非洲猪瘟检测方法。本发明的方法用荧光显微镜直接进行观察判断，省去了染色、复染、脱水、 透明等操作，更简单易行，节约时间和成本；而且荧光光稳定性增加，与现有免疫组织化学显色方法相比较，分析的准确度和检测的灵敏度有所提高。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤步骤一，将表面带有羧基或氨基的水溶性量子点与非洲猪瘟单克隆抗体连接(1)如果是表面带有羧基的水溶性量子点，则首先将量子点分散在硼酸盐缓冲溶液中，然后加入硫化二亚胺和单克隆抗体，混合，25°C下反应3小时，离心，洗涤，得到量子点标记的单克隆抗体复合物；其中，量子点硫化二亚胺单抗的摩尔比为60 15 1 ；(2)如果是表面带有氨基的水溶性量子点，则首先将量子点分散在含有体积分数为1.25%的戊二醛的磷酸缓冲溶液中，超声使之完全分散，25°C下摇床活化反应3小时，加入单抗，在4°C下反应M小时，离心，洗涤，得到量子点标记的单抗复合物；其中，量子点 戊二醛单抗的摩尔比为60 15 1 ；步骤二，将切片标本先放入二甲苯中脱蜡2次，然后置入无水乙醇中梯度水化， 水洗，过氧化氢灭活内源性过氧化氢酶，微波抗原修复，水洗后用BSA封闭，4°C反应过夜， 磷酸缓冲溶液洗后加入量子点标记的非洲猪瘟单克隆抗体复合物，避光条件下37°C反应 30-60分钟，磷酸缓冲溶液漂洗，甘油封片；磷酸缓冲溶液替代抗体复合物作为阴性对照， 在荧光显微镜下观察样本。步骤一中，所述硼酸盐缓冲溶液的PH为8. 32。步骤一中，所述磷酸缓冲溶液的PH为7. 2。步骤一中，所述表面带有羧基或氨基的水溶性量子点为hP，InAs, InCaAs, InAs/ Cdse, InAs/ZnSe, InAs/InP, ZnS, CdS, HgS, ZnSe, CdSe, HgSe, PbSe, HgTe, CaAs, CdS/ZnS, CdS/Pbs, ZnS/CdS, ZnS/CdS, CdSe/CdS, CdSe/Cuse, CdSe/HgTe, CdSe/ZnSe, CdSe/HgSe, CdTe, MgS, Mgse，MgTe, CaS, Case 或 CaTe 中的一种或几种的组合。步骤一中，所述表面带有羧基或氨基的水溶性量子点，发射波长为520nm-680nm。步骤二中，所述量子点标记的非洲猪瘟单克隆抗体复合物具体为，将步骤一得到的量子点标记的抗体复合物稀释200倍。本发明利用量子点的荧光特性，将其与抗体(抗原)偶联，直接与细胞或者组织中的相关抗原(抗体)反应并显色，以确定细胞或者组织中的化学成分及其分布。本发明根据量子点半径的不同，以细胞出现各种绿色、黄色、橙红色的荧光信号的为阳性。本发明具有如下的有益效果本发明是基于标准的免疫组织化学方法基础上的， 利用纳米量子点的荧光性能，不用传统的显色过程，而是用荧光显微镜直接进行观察判断， 省去了染色、复染、脱水、透明等操作，更简单易行，节约时间和成本；而且荧光光稳定性增加，与现有免疫组织化学显色方法相比较，分析的准确度和检测的灵敏度有所提高。
具体实施例方式下面对本发明的实施例做详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例
检测方法分析非洲猪瘟病毒在猪脾脏及扁桃体中是否存在，使用量子点标记的非洲猪瘟病毒单克隆抗体，磷酸缓冲溶液(PBS)替代该单抗做阴性对照。硼酸盐缓冲溶液的配方为十水四硼酸钠3. 81g，加双蒸水定容到1000ml，PH为8. 32。磷酸缓冲溶液的配方为氯化钠8g氯化钾0. 2g磷酸氢二钠 1. 44g磷酸二氢钾 0. 24g加双蒸水至IOOOml，PH调至7. 2。步骤一，将表面带有羧基的水溶性CdTe量子点分散在硼酸盐缓冲溶液(PH = 8.32)中，加入硫化二亚胺(EDC)和非洲猪瘟病毒单克隆抗体，漩涡混合振荡均勻，25°C反应3小时，反应溶液高速离心，用磷酸缓冲溶液(PBS，0. 1M，PH= 7. 2)多次洗涤，得到量子点标记的单抗复合物(QDl-antibody)；或者将表面带有氨基的CcKeOZnS水溶性量子点分散在含有体积分数为1. 25%的戊二醛浓度的磷酸缓冲溶液(PH = 7. 2)中，超声使之完全分散，摇床活化25°C反应3小时， 加入非洲猪瘟病毒单克隆抗体，在4°C下反应M小时，反应溶液离心，用磷酸缓冲溶液(PH =7. 2)多次洗涤，得到量子点标记的单抗复合物(QD2-antib0dy)。步骤二，选取多种猪的脾脏和扁桃体作为样本，以猪的肌肉组织为对照，应用基于量子点的免疫组织化学的方法来定性分析检测非洲猪瘟病毒。将取得的猪脾脏、扁桃体及肌肉组织切片标本先放入二甲苯中脱蜡两次；然后置于无水乙醇中梯度水化，水洗，过氧化氢灭活内源性过氧化氢酶，微波抗原修复，水洗后用正常山羊非免疫血清封闭，磷酸缓冲溶液洗后加入1 300稀释的用量子点标记的非洲猪瘟病毒单克隆抗体(QDl-antiibody或者QD2-antiiib0dy)，在避光条件下孵育，37°C反应 30-60分钟；磷酸缓冲溶液漂洗3次，甘油封片，在荧光显微镜下直接观察样本，ASFV阳性显色为红色荧光，定位于细胞浆，少量定位于细胞核，磷酸缓冲溶液替代量子点标记的单抗作为阴性对照。本实例以连接有非洲猪瘟病毒单克隆抗体的量子点作为免疫组织化学的优良的荧光成像剂，可以大大加速并且提高检测的灵敏度和分析的准确度。
权利要求
1.基于量子点技术的一种非洲猪瘟检测方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，将表面带有羧基或氨基的水溶性量子点与非洲猪瘟单克隆抗体连接，(1)如果是表面带有羧基的水溶性量子点，则首先将量子点分散在硼酸盐缓冲溶液中， 然后加入硫化二亚胺和二抗，混合，25°C下反应3小时，离心，洗涤，得到量子点标记的抗体复合物；其中，量子点硫化二亚胺二抗的摩尔比为60 15 1 ；(2)如果是表面带有氨基的水溶性量子点，则首先将量子点分散在含有体积分数为 1. 25 %的戊二醛的磷酸缓冲溶液中，超声使之完全分散，250C下摇床活化反应3小时，加入抗体，在4°C下反应M小时，离心，洗涤，得到量子点标记的抗体复合物；其中，量子点戊二醛二抗的摩尔比为60 15 1 ；步骤二，将切片标本先放入二甲苯中脱蜡2次，然后置入无水乙醇中梯度水化，水洗， 过氧化氢灭活内源性过氧化氢酶，微波抗原修复，水洗后用BSA封闭，40C反应过夜，磷酸缓冲溶液先后加入量子点标记的抗体复合物，避光条件下37 V反应30-60分钟，磷酸缓冲溶液漂洗，甘油封片；磷酸缓冲溶液替代一抗作为阴性对照，在荧光显微镜下观察样本。
2.根据权利要求1所述的基于量子点基础上的免疫组化分析检测方法，其特征是，步骤一中，所述硼酸盐缓冲溶液的PH为8. 32。
3.根据权利要求1所述的基于量子点基础上的免疫组化分析检测方法，其特征是，步骤一中，所述磷酸缓冲溶液的PH为7. 2。
4.根据权利要求1所述的基于量子点基础上的免疫组化分析检测方法，其特征是，步骤一中，所述表面带有羧基或氨基的水溶性量子点为hP，InAs, InCaAs, InAs/Cdse, InAs/ ZnSe, InAs/InP, ZnS, CdS, HgS, ZnSe, CdSe, HgSe, PbSe, HgTe, CaAs, CdS/ZnS, CdS/Pbs, ZnS/ CdS, ZnS/CdS, CdSe/CdS, CdSe/Cuse, CdSe/HgTe, CdSe/ZnSe, CdSe/HgSe, CdTe, MgS, Mgse, MgTe, CaS, Case或CaTe中的一种或几种的组合。
5.根据权利要求1所述的基于量子点基础上的免疫组化分析检测方法，其特征是，步骤一中，所述表面带有羧基或氨基的水溶性量子点，发射波长为520nm-680nm。
6.根据权利要求1所述的基于量子点基础上的免疫组化分析检测方法，其特征是，步骤二中，所述量子点标记的抗体复合物具体为，将步骤一得到的量子点标记的抗体复合物稀释200倍。
全文摘要
一种纳米材料领域的基于量子点基础上的免疫组化分析检测方法，包括如下步骤(1)首先将量子点分散在硼酸盐缓冲溶液中，然后加入硫化二亚胺和二抗，混合，反应，离心，洗涤，得到量子点标记的非洲猪瘟单克隆抗体复合物；其中，量子点∶硫化二亚胺∶二抗摩尔比为60∶15∶1；或者(2)首先将量子点分散在含有体积分数为1.25％的戊二醛的磷酸缓冲溶液中，分散，反应，加入二抗，反应，离心，洗涤，得到量子点标记的非洲猪瘟单克隆抗体复合物；其中，量子点∶戊二醛∶二抗摩尔比为60∶15∶1；之后按照标准免疫组化检测方法进行免疫反应和观察。本发明的方法用荧光显微镜直接进行观察，简单易行，荧光光稳定性增加，分析的准确度和检测的灵敏度有所提高。
文档编号G01N33/577GK102279265SQ20101019536
公开日2011年12月14日 申请日期2010年6月9日 优先权日2010年6月9日
发明者陈文刚 申请人:陈文刚