专利名称：一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备。具体地，利用基因重组技术，将非洲猪瘟重要结构蛋白P72、P54以及红细胞凝集素HA多个T细胞表位和纯化标签串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到具有细胞免疫和体液免疫效果的非洲猪瘟蛋白工程疫苗，用于非洲猪瘟疫情的防控。
背景技术：
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒ASFV引起的猪的一种急性、热性传染性疫病。国际兽医局将其列为A类动物疫病，我国已将此病规定为一类动物传染病。ASFV是一个复杂的二十面体病毒，其特征与虹彩病毒科和痘病毒科的成员相似。ASFV为双股线性DNA基因组，根据病毒株的不同其大小为170 190 kbCBlasco等，1989 ;Tabares等，1980)。ASFV是一种非常复杂的病毒，基因组共有150多个开放阅读框，共编码100多种多肽，在不同的实验室所得到的结果有一定差异。ASFV病毒可以编码34种以上的结构蛋白，虽然病毒的结构蛋白很多，但是证实具有抗原性的蛋白仅有几种，Tabares (1980)等发现6种，VP72，VP162，VP146，VP54，VP34，VP23.5，其中p72、p54、p30和pl2，具有良好的抗原性。P72是一个主要的衣壳蛋白，占整个病毒粒子总蛋白的32%，国外研究表明，不同区域的ASFV病毒诱导产生的P72抗体的相应抗原表位都相当保守，而且抗原性很稳定，常被用来作为血清学检测和免疫制剂。膜结构蛋白P54由D183L基因编码，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网膜处，其与轻链细胞质动力蛋白DLC8存在特殊的交叉反应，并在细胞内摄作用及病毒加工过程中其重要作用。感染病毒后复制早期，病毒可激活细胞凋亡蛋白酶，诱发细胞脱噬作用。
ASFV有很好的抗原性，在感染期间能诱导产生高水平的特异性抗体。在感染后4d能检测到IgM,感染后6 8 d能检测至Ij IgG (Sanchez- Vizcaino等，1979)。并且初次感染后血清中的抗体能维持很长一段时间。抗ASFV的抗体能延迟临床症状的出现，减轻病毒血症，并能保护感染猪不会死亡(Onisk等，1994 ;Schlafer等，1984)。早期的实验表明实验感染和自然感染ASFV的猪血清中没有中和抗体。然而，康复猪用口蹄疫疫苗免疫时能产生正常水平的中和抗体，该实验证明了 ASFV对体液免疫反应不存在负面影响(De Boer,1967)。其他学者(Ruiz Gonzalvo等，1986)也证明不同的ASFV分离株大部分能被恢复期血清中和，但总有10%的ASFV不能被中和。另外，Gomez-Puertas等(1996)报道，恢复期猪血清中的ASFV抗体能有效地中和感染易感细胞之前或之后的ASFV。然而，现在还不能证明ASFV的特异性抗体完全符合经典的病毒中和试验；另一方面，来自康复猪的细胞毒性T淋巴细胞能杀死感染ASFV的巨噬细胞(Martins和Leitao，1994)，这表明细胞介导的免疫反应可能是保护性免疫反应的重要组成部分。尽管研究人员已经对ASFV的生物学知识已经有了深入的了解，但目前还无法治疗ASF，也没有有效的疫苗来预防ASF。自从1963年第一个ASF弱毒疫苗在葡萄牙应用以来(Manso Ribeiix)等，1963)，人们做了许多努力以期制备满意的疫苗。灭活疫苗不能产生任何保护作用。弱毒活疫苗能使一些猪免受同源ASFV毒株的感染，但是这些猪部分会成为病毒携带者或出现慢性病变，当大规模使用弱毒活疫苗时，这种可能性会增加(MansoRibeiro等，1963 ;Sanchez Botija, 1963)。其他研究表明，抗同源或一些异源ASFV毒株的猪血清能抑制(体外)与异源毒株相关但与异源毒株不同的毒株对细胞的感染(RuizGonzalvo等，1986)。近年来的发现表明，针对ASFV蛋白p30、p54和p72的中和抗体不足以产生抗体介导的免疫保护(Neilan等，2004)。以往的疫苗均是以灭活疫苗和弱毒疫苗为基础进行尝试，但效果均不理想。未来进一步开发以特异性靶向基因剔除(如编码入侵宿主防御系统的基因)为目标的安全性好和效力高的重组弱毒疫 苗可能会产生较好的效果。尽管分子生物学技术已经成功应用于界定体内ASFV相关毒力因子，但时至今日，由于其残余的毒力，仍没有证据表明合格的重组弱毒疫苗开发成功。研究人员(Jordi M.Argilaguet等,2012)基于成功诱导免疫反应抗原特性，开发了 DNA疫苗，但是免疫后仅能诱导部分保护。ASF抗体调节要求多个针对许多不同病毒蛋白的反应，有些可能涉及病毒中和反应。也可能是一些尚未发现的中和表位在保护中发挥了重要作用。HA为红细胞凝集素，能够在体外缺少ASFV的情况下产生对红血球的凝集反应(Ruiz-Gonzalvo，F，1993)。使用非纯化的HA免疫靶动物，可以抵抗同源病毒的感染(Ruiz-Gonzalvo，F，1993)。ASFV基因组结构分析表明基因之一与T细胞粘附受体相似的序列⑶2，这个蛋白直接参与红细胞吸附现象，而ASFV感染免疫细胞亦会诱导此现象(Borca，M.V.等，1994)，研究人员认为⑶2与HA为同一蛋白。研究表明HA蛋白是病毒粒子的次要组件，而且只能通过HA蛋白的高抗体滴度才能检测到。电镜扫描研究表明(Quintero，J.C等，1986)，病毒粒子粘附后并不穿透红血球，而是通过一个通道连接在表面外层.HA可以调节这种粘附作用，用这种方式，病毒粒子侵染免疫系统，这可以解释为什么ASFV感染后幸存猪都要经历一个漫长的病毒血症阶段。众多研究表明ASFV HA含有诱导感染抑制的表位，血凝抑制可能会不同(Blasco，R.等 1989 ;Carrascosa, A.L 等 1987 ;del Val, M 等 1986)。F.Ruiz-Gonzalvo (1996)等的研究结果也表明抗体调节机制可能有助于抵抗疾病，HA似乎是部分免疫保护抗体的目标。但是HA并非真正的抗原(Ruiz-Gonzalvo, F, 1993),可能它对于接种较高剂量重组蛋白从而产生较好的保护效果或者提高抗原提呈给免疫系统是必须的。
发明内容
本发明根据已分离的非洲猪瘟病毒保守结构蛋白P72，膜结构蛋白P54与红细胞凝集素HA的多个T细胞表位联合后与纯化标签串联，在大肠杆菌中实现表达，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的蛋白工程疫苗。本发明提供的疫苗制备方法可保证疫苗能够激发有效的细胞免疫及体液免疫，能够用于预防非洲猪瘟流行。本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防非洲猪瘟的疫苗多肽及其疫苗组合物。本发明的目的之二在于提供了所述蛋白工程疫苗的构建及获得方法。本发明的目的之三在于提供了能够表达所述非洲猪瘟蛋白工程疫苗的基因工程菌株。
本发明的目的之四在于提供了所述非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备方法。本发明的目的之五在于提供了所述蛋白工程疫苗在免疫靶动物体内能够诱发有效的细胞免疫及体液免疫反应。在第一方面，本发明提供了一种用于非洲猪瘟预防的疫苗多肽及其组合物。其含有非洲猪瘟保守结构P72和膜蛋白P54，同时，由于红细胞凝集素HA能够诱导有效的细胞免疫反应，因此，我们利用分子生物学软件分析HA蛋白的T细胞表位，将获得表位与结构蛋白串联，获得完整的具有细胞免疫和体液免疫效果的非洲猪瘟蛋白工程疫苗蛋白。所述蛋白工程疫苗包括主要结构蛋白以及HA T细胞免疫表位串联到一起所形成的蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及多肽、蛋白所需要的载体。串联可以通过遗传工程方法进行，蛋白工程疫苗中除了含有主要结构蛋白和红细胞凝集素T细胞免疫表位外，还包含非免疫活性物质。所述非免疫活性物质为各个多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的非洲猪瘟疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通过人工合成方式合成蛋白工程疫苗基因片段，经过基因工程操作，将基因片段克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得猪瘟疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如:PCR、限制性内切酶酶切，连接等。核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点，所述的基因操作技术为本领域技术人员所熟知。在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码非洲猪瘟蛋白工程疫苗氨基酸的核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。在一优选实施方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的非洲猪瘟蛋白工程疫苗。在第五方面，本发明提供了一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备方法，其包括以下步骤:工程菌发酵表达蛋白工程疫苗多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续乳化工艺，获得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、复性、乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。在第六方面，本发明提供了一种用于预防非洲猪瘟的疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为50V2佐剂。在第七 方面，本发明提供了第六方面所述的蛋白工程疫苗的应用。疫苗可以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射免疫动物，能够激发机体的体液免疫和细胞免疫反应。另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书说界定的本发明范围。图1为含有非洲猪瘟蛋白工程疫苗蛋白编码基因的表达载体pRSETB-ASFV (P72/54) -HA 示意图。图2为限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳图,其中Ianel为DNA marker,由上至下依次为 2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，IOObp ；lane2 为 pRSETB-ASFV (P72/54)-HA 质粒双酶切图；lane3为pRSETB-ASFV(P72/54)-HA完整质粒；lane4为阴性对照。图3为工程菌菌种诱导表达后SDS-PAGE分析结果，其中Ianel为pRSETB - ASFV(P72/54)-HA/ BL21 (DE3，Plys)工程菌诱导表达(箭头所指为目标蛋白)；lane2为蛋白marker,由上至下依次为 97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD ；lane3 为未诱导表达阴性对照菌。图4为纯化蛋白WESTERNBL0T印记结果，其中I为预染蛋白分子量marker，由上至下依次为:95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、26KD ；2为纯化的疫苗蛋白；3为阴性对照。图5首免、二免、三免后14天抗体检测结果 图6 IFN Y-ELISP0T检测结果
具体实施例方式实施例中所述的具体试 验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本说明书的诸多变化为本领域的技术人员所熟知。实施例一非洲猪瘟蛋白工程疫苗框架的设计思路
综合非洲猪瘟病毒的生物学特性，本发明利用DNAStar及ANTHEPR0T软件对其红细胞凝集素HA进行的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析，预测可能的细胞免疫表位，并将主要保守结构蛋白P72，膜蛋白P54与T细胞表位串联，作为蛋白工程疫苗的骨架结构该疫苗的总体结构为:P72-P54-HA。实施例二大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建
实施例一中设计好的多肽编码核苷酸由上海英俊生物技术公司合成，P72-P54-HA基因片段两端分别设计了 EcoR I (5’端)和HindIII (3’端)限制性内切酶位点。上海英俊生物技术公司把片段合成后克隆到PMD18T载体上，提取质粒并测序正确后，将重组质粒命名为PMD18T-ASFV(P72/54)-HA，将含有重组质粒的大肠杆菌寄回本公司。将含有pMD18T-ASFV(P72/54)-HA重组质粒的大肠杆菌菌株接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，37°C振荡过夜培养，次日按照Qiagen质粒提取试剂盒使用手册。将质粒使用相应的限制性内切酶进行处理，大肠杆菌表达载体选用Pharmacia biotech公司的pRSETB质粒，使用限制性内切酶EcoRI和HindIII处理，酶切条件:10μ I反应体系，体系内加入2 μ I质粒，限制性内切酶为5个活性单位(New England biolabs)，加入IOX缓冲液I μ 1，去离子水补齐，37°C酶切1.5小时。酶切结束后加入Iy 1200mM EDTA终止反应。在1%琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.9kb pRSETB质粒、1039bp的ASFV(P72/54)-HA片段，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体:片段1:2-3的比例将蛋白工程疫苗核苷酸片段和表达载体混合，反应体系15 μ 1，由T4 DNA连接酶进行连接，16°C连接过夜，获得重组质粒命名为pRSETB-ASFV (Ρ72/54)-HA (见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3 ) pLysS。感受态大肠杆菌BL21 (DE3)细胞的制备:取一大肠杆菌BL21 (DE3)单菌落于2mlLB培养基中，37°C，200rpm速度振荡培养12-16小时，取Iml培养物接种于IOOmlLB培养基中，37°C，200rpm速度培养3小时；将菌液冰浴2小时，然后2500g，低温离心20分钟，收集菌体；加入 IOOml 冰冷的 Trituration 缓冲液(100mmol/L CaCl2, 70mmol/L MgCl2,40mmo1 /L醋酸钠，PH5.5)，混匀，置冰浴45分钟，1800g低温离心15分钟，弃上清，加入IOml冰冷Trituration缓冲液悬浮细胞，按每份200 μ I分装，_70°C保存备用。转化:将200 μ I感受态细胞置冰上融化，然后加入3 μ 1DMS0,混匀，加入2 μ I链接反应液，再次混匀，置冰上30分钟，42°C 45秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入2mlLB培养液，37°C，200rpm振荡培养I小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200 μ ILB培养基重悬菌体；将菌液铺于含有氨苄青霉素抗性的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置30分钟，倒置于37°C恒温箱中培养12-16小时。筛选平板上的克隆，提取质粒，EcoR I和HindIII双酶切，可以切出相应非洲猪瘟蛋白工程疫苗基因大小的片段初步确定为阳性克隆见图2。诱导表达:即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1:100转接，培养3小时后，加入0.5mM IPTG，继续培养3小时，制备样品；常规SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况——在42.9KD分子量处，见到特异性条带为正确克隆；取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，将目标蛋白纯 化后使用常规western-blot进一步证实其表达准确性,见图3,图4 ;将获得的菌种委托北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序。经过上述构建及鉴定程序后，可挑选测序正确的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立及菌种保藏，菌种命名为 pRSETB-ASFV (P72/54)-HA/ BL21 (DE3，Plys)。实施例三工程菌的发酵、纯化与乳化
发酵取生产用基础种子库菌种，开启后划种培养基(LB+Amp)平板2 3块，培养后挑取平板中典型集落8 10个，分别培养后保存，然后分别进行非洲猪瘟蛋白工程疫苗融合蛋白表达量测定，重复三次，选其中非洲猪瘟蛋白工程疫苗融合蛋白表达量最高的一份供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种库的表达量。挑取单菌接种于试管LB液体培养基中，在摇床中37°C培养震荡12小时。将试管中的菌以1:100的接种量接入摇瓶，37°C遥床培养至0D600=3，即可以按10%比例接种发酵罐。发酵用培养基为改造的LB培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素，对发酵罐进行溶氧和PH值的校正，进行实罐灭菌。降温至37°C时，调整转数至300rpm，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0±0.1°C,根据工程菌生长情况到后期可适当调整温度，并作必要的培养基成分添加，溶氧控制在20%左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体0D600=1.0 1.2时流加补料500ml，补料后I小时加入IPTG (终浓度为ImM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况。纯化将收集到的菌体，每IOOg用包含体洗液1(1% Triton X-100，20mMTris-cl PH8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解I小时。包含体沉淀用8M尿素，0.3%β -ME，20mM Tris-cl (pH=8.00)混匀，室温搅拌 4 小时，8000rpm低温离心 30min，弃去沉淀。上清液保留，并用BCA protein assay kit商品化试剂盒(PIERCE)检测蛋白浓度。采用稀释复性法将变性蛋白复性，蛋白终浓度为lOOyg/ml。复性液采用Tris(PH8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4°C搅拌复性48小时。复性液用pH=8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH=8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，
0.5M 咪唑洗脱；再用 1.5M(NH4) 2S04UOOmM EDTA, pH=8.5 的 IOmM Na2HPO4 平衡上疏水层析柱，再平衡，用pH=8.5的IOmM Na2HPO4洗脱，即得非洲猪瘟蛋白工程疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及WESTERNBL0T印记确定纯化产物为目标蛋白。乳化将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至200 μ g /ml。取法国赛比克公司50V2佐剂经121°C，灭菌15分钟，备用。按油相:水相=50:50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2min，然后以5500 r/min高速循环乳化9min,制成油包水单相疫苗。实施例四重组非洲猪瘟蛋白工程疫苗安全性试验 材料
疫苗:重组非洲猪瘟蛋白工程疫苗，批号20120301，20120302, 20120303。试验动物(I) 18_22g小白鼠17只，购自青岛市药检所，30日龄，三元杂交断奶仔猪8头，城阳区红岛镇大西洋村生猪养殖场提供。
方法
疫苗对小白鼠的安全性
皮下注射小白鼠，每只注射0.5ml，每批疫苗注射5只，共注射15只小白鼠。同时设定2只阴性对照，每只皮下注射生理盐水50V2乳剂0.5ml。连续观察10天，观测小白鼠的健康状况。疫苗对仔猪的安全性
仔猪共分为三个批次组和空白对照组，每组2头。批次组耳后肌肉注射研发中心提供的非洲猪瘟蛋白工程疫苗2ml/头，空白对照组耳后肌肉注射生理盐水50V2乳剂2ml/头。连续观察10天，观测仔猪的健康状况。结果
疫苗对小白鼠的安全性试验 结果见表1，免疫组与对照组一致，无死亡发生，无任何临床不良症状出现，可见重组非洲猪瘟蛋白工程疫苗对小白鼠是安全的。
权利要求
1.一种用于预防非洲猪瘟的蛋白工程疫苗蛋白。
2.—种核酸分子，其编码权利要求1所述蛋白工程疫苗蛋白氨基酸序列。
3.—种载体,其含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种宿主细胞,其含有权利要求3所述的载体。
5.权利要求1所述的非洲猪瘟蛋白工程疫苗蛋白，其最优组合具体核酸序列组合为:SEQ ID N0.3-SEQ ID N0.5-SEQ ID N0.10
6.权利要求1所述的非洲猪瘟蛋白工程疫苗蛋白，其最优组合具体氨基酸序列组合为:SEQ ID N0.4 -SEQ ID N0.6-SEQ ID N0.8。
7.权利要求5 所述的核酸序列为SEQID N0.1具体如下:
8.权利要求6所述的氨基酸序列为SEQID N0.2具体如下:YPRHYGECSSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEVTPQPGTSKPAGATTASAGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDAPAHPTEPYIENLRQRNTYTHKDLEGGPRVDCRCGDKFPSKFCYGGNAIKTPDDPGALKPREEYQPSGHINVSRAREWDTDYGSGYYDNNRSNKNNNGTNVNDTNGDINDTNGDIIRRKRKKHVEEIESPPPSESNEEDISHDDTTSIHEPSPREPLLPKPYSRYQYNTPIYYMRPSTQPLNPFPLPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCSPPKPCRPPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCPPSKPCPSPQSYSPPKPLP。
9.一种用于预防非洲猪瘟的疫苗，其包括权利要求8所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备。所述疫苗含有非洲猪瘟病毒ASFV主要稳定结构蛋白P72，膜结构蛋白P54，以及红细胞凝集素的T细胞表位多肽以及纯化标签。本疫苗生产制备工艺稳定，适合大规模生产。经过靶动物仔猪和小白鼠动物实验表明，本发明所述的非洲猪瘟蛋白工程疫苗具有使用的安全性，且疫苗能够诱导显著的细胞免疫反应及体液免疫反应。
文档编号A61K39/12GK103172749SQ20131003876
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者李殿明, 蒲勤, 齐春梅, 李毅, 田春辉, 刘甜甜, 任百亮, 张导春 申请人:青岛红桥明勤生物科技有限公司