人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体设及一种人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙 型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 人类免疫缺陷病毒化Uman Immunodeficien巧VirusJIV)是艾滋病的病原体。该 病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得W在人 体内生存，至今无有效疗法。2015年统计结果:全球范围内有3500万HIV感染者，中国有近50 万，居全球第12位。HIV根据血清学和病毒核酸序列可分为二型:HIV-I和HIV-2,全球绝大部 分地区流行的是HIV-I型，HIV-2型只在非洲局部地区流行。
[0003] 乙型肝炎病毒化BV)和丙型肝炎病毒化CV)是导致病毒性肝炎的2种主要病毒类 型，中国有9000万乙肝病毒携带者，有超过2500万的丙肝病毒感染者。据不完全统计，在乙 肝携带者中有760万人同时也是丙肝感染者。而在HIV感染者人群中，同时感染有皿V/HCV的 患者也为数众多，而皿V/HCV导致的肝脏疾病也是HIV患者发病和死亡的主要原因。HIV, 皿V，HCV运S种病毒之间的混合感染使得患者病情复杂化，给原有的针对性抗病毒治疗造 成了很大挑战。例如:HBV/HCV混合感染中HCV的感染对皿V的复制有抑制作用，因此治疗HCV 过程中要防止皿V病情的反弹;皿V/HIV混合感染中，皿V的基因产物可能促进HIV的复制，加 速HIV的疾病进程等等。因此，对患者进行多重病毒的同时检测非常重要。
[0004] 目前针对HIV，皿V，HCV病毒的检测和诊断方法还是W血清学方法中对相关抗体的 检测作为判断病毒感染的金标准，病毒核酸和检测为辅助手段。基于血清学反应的检测方 法所检测的是人体对病毒产生的抗体而不是病毒本身，在病毒感染早期，即"窗口期"，人体 内虽有病毒感染但还未产生抗体或者产生的抗体数量未达到抗体反应的最低检测限，此时 血清学抗体检测结果一般为阴性。而HIV，皿V，HCV运S种病毒都有较长的窗口期，不能满足 对于病毒感染"早发现，早诊断，早治疗"的需要。基于聚合酶链式反应(PCR)技术的核酸分 子检测方法的检测对象是病毒自身的遗传物质，W血清中病毒核酸的存在作为病毒感染和 复制的直接标志物，大大缩短了病毒检出的"窗口期"，适用于病毒感染的早期诊断。其中， 实时巧光定量PCR技术不仅可W对病毒进行定性检测，还可W进行定量分析，并且具有较高 的灵敏度、特异性和准确性，越来越多的应用在各种病毒的临床/实验室检测中，并被国家 发布的相关病毒防治指南所承认。
[0005] 目前，市场上已有多种针对HCV，皿V，HIV的单项核酸检测/分型产品，但对于有混 合感染情况的患者而言，对每种病毒分别进行单次检测的总成本较高，等待检验结果的时 间较长。而对于医院实验室的检验人员来说，由于每种病毒检测使用的基因标志物和扩增 程序不同，单个病毒单次检测的操作繁琐，耗时较长，通量低，不适于临床检验和大规模的 血液筛查。
【发明内容】
[0006] 针对传统检测手段中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种人免疫缺陷病 毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[000引本发明的第一方面，提供一种人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速 联检试剂盒，包括HIV检测引物及探针、HBV检测引物及探针、HCV检测引物及探针，所述HIV 检测引物包括核巧酸如SEQ ID NO. 1所示的上游引物和核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示的 下游引物，HIV检测探针的核巧酸序列如SEQ ID NO. 3所示;所述皿V检测引物包括核巧酸如 SEQ ID NO.4所示的上游引物和核巧酸序列如SEQ ID NO. 5所示的下游引物，皿V检测探针 的核巧酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述HCV检测引物包括核巧酸如SEQ ID NO.7所示的上 游引物和核巧酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物，HCV检测探针的核巧酸序列如SEQ ID NO. 9所示;所述HIV检测探针、皿V检测探针和HCV检测探针上标记有巧光报告基团和巧光泽 灭基团。
[0009] 优选地，所述HIV检测探针、皿V检测探针和肥V检测探针的5 '端标记有巧光报告基 团，3 '端标记有巧光泽灭基团。
[0010] 进一步优选地，所述HIV检测探针5 '端标记的巧光报告基团为FAM巧光基团，3 '端 标记的巧光泽灭基团为B册-1。
[0011] 进一步优选地，所述皿V检测探针5 '端标记的巧光报告基团为CY5巧光基团，3 '端 标记的巧光泽灭基团为B册-3。
[0012] 进一步优选地，所述HCV检测探针5 '端标记的巧光报告基团为皿X巧光基团，3 '端 标记的巧光泽灭基团为B册-1。
[0013] 本发明的试剂盒采用多重巧光PCR技术在单管中同时进行人免疫缺陷病毒、乙型 肝炎病毒、丙型肝炎病毒检测，根据扩增及检测情况可分析判断人免疫缺陷病毒、乙型肝炎 病毒、丙型肝炎病毒感染情况。因此，引物及探针的设计是本发明试剂盒的关键。
[0014] 基于本发明所述试剂盒是采用多重巧光PCR技术来进行检测的，所W试剂盒中还 可W包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如:dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、逆转录酶、Taq DNA 聚合酶、无菌水(DEPC-d地2〇)等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂 均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可W根 据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
[001引所述PCR反应体系中，引物、探针、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、逆转录酶、Taq DNA聚合 酶、无菌水(DEPC-dd出0)均为常见组分，其含量亦为常规。
[0016] 所述PCR反应体系可自行配置，也可直接W市售的不含引物及探针的通用PCR反应 液加入引物及探针获得。例如，所述试剂盒中还可W含有dNTP、MgCb、PCR缓冲液、逆转录 酶、Taq DNA聚合酶、无菌水(DEPC-dd此0)。加入本发明的引物及探针、待检样本即可获得 PCR反应体系。
[0017] 所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有HIV特异性扩增片段的假 病毒、含有皿V特异性扩增片段的假病毒和含有HCV特异性扩增片段的假病毒。
[001引优选地，HIV特异性扩增片段的核巧酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0019] 优选地，HBV特异性扩增片段的核巧酸序列如沈Q ID NO. 11所示。
[0020] 优选地，HCV特异性扩增片段的核巧酸序列如SEQ ID NO. 12所示。
[0021] 优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为PCR反应缓冲液、无菌水 (DEPC-ddH2〇)、生理盐水等。
[0022] 本发明的第二方面，提供了前述人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快 速联检试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0023] (1)提取样品核酸；
[0024] (2)加样:将样品核酸、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管 中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述HIV检 测引物及探针、皿V检测引物及探针、HCV检测引物及探针；
[0025] (3) PCR反应:反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
[0026] (4)PCR反应结束后，分析结果。
[0027] 步骤(1)中，提取样品核酸为现有技术。
[0028] 优选地，步骤(3)中，PCR 反应的条件设置为：（a)45°C10min;(b)95°C15min;(c)95 °C15sec; ((1)60°[6036。;步骤(。)-((1)循环45次。
[0029] 本发明的第=方面，提供了前述试剂盒在制备人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙 型肝炎病毒快速联检产品中的用途。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0031 ] 使用多重巧光PCR技术，在