一种抑制乙型肝炎病毒的双功能3p-siRNA及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种双功能高效特异抑制HBV复制的5’-ppp-siRNA(3p-siRNA)的合成及应用。该3p-siRNA一方面通过RNAi机制特异性沉默HBV靶基因表达，同时还通过RIG-I依赖机制激活宿主干扰素表达、经抗病毒天然免疫反应表现抗病毒效应，是一种兼备RNAi和激活宿主抗病毒天然免疫效应的双功能抗HBV新型3p-siRNA；该3p-siRNA毒性较小，能高效激活RIG-I介导的宿主天然抗病毒干扰素(IFN)表达，同时显著抑制HBV的HBeAg和HBsAg分泌以及DNA复制并呈明显剂量依赖性。本发明所述的抗HBV双功能3p-siRNA采用体外转录方法和人工化学合成方法制备，可用于HBV新型药物研究和开发。本发明所述的双功能3p-siRNA可以应用于其它人类重要病毒和细菌新型核酸类药物研究和开发。
【专利说明】—种抑制乙型肝炎病毒的双功能3p-siRNA及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种抑制乙型肝炎病毒的双功能3p_siRNA的合成及其应用。
【背景技术】:
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是`一种可以全球性感染的病毒,具有组织和种属特异性，可导致慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌，主要感染成人，严重影响人类的健康与生命安全。中国是HBV感染大国，每年直接用于治疗的费用高达500亿人民币。目前针对慢性HBV感染者和携带者没有特效治疗方法。HBV基因组较小，易发生突变，限制了靶向病毒的抗病毒药物应用。核酸类药物和干扰素-α是目前最常用的治疗HBV药物，但是面临着停药“反跳”以及耐药等问题。至今没有一种能够彻底治愈HBV的特效药物。
[0003]RNA 干扰技术是基于 RNA 干扰(RNA inter-ference, RNAi)现象，由 dsRNA、siRNA或shRNA介导，通过对同源互补靶基因mRNA的降解而实现特异性基因沉默的技术。siRNA在特异性降解同源互补的mRNA的同时也可能受到“脱靶效应”的干扰而降低敏感性。“脱靶效应”产生的原因是:非靶基因与siRNA部分互补，或是外源性RNA以病毒感染的方式触发了宿主免疫传感元件。通过对siRNA的5'端进行磷酸化修饰，生成5’-ppp-siRNA (3p-siRNA)，不仅沉默特异性基因表达，可以避免“脱靶效应”。3p-siRNA是一类具有21-25个核苷酸的特殊dsRNA分子，其序列与靶mRNA序列具有同源性，其双链均由5’端3个磷酸基团和3’端羟基基团构成，每条单链的3’端均有2个突出的非配对碱基。如图1所示。
[0004]对普通RNA分子的5 ’端进行磷酸化修饰,生成5 ’ -ppp-RNA (3p-RNA),可以结合并活化维甲酸诱导基因I (retinoic-acid-1nducible gene I，RIG-1),是RIG-1特有的配体，能够被天然免疫系统识别，激活RIG-1介导的干扰素(IFN)通路。目前，此种性质仅见于RNA分子。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是:利用5’ -ppp-RNA激活RIG-1信号通路的性质，将这一特性拓展用于siRNA分子，提供一种沉默HBV特定基因同时又激活天然免疫通路的抗HBV双功能核酸类药物。
[0006]具体来说，本发明针对HBV基因组的特定区域，设计一种能够特异性沉默HBV基因组表达的3p-siRNA序列，该序列为双链RNA，其双链均由5’端3个磷酸基团和3’端羟基基团构成，每条单链的3’端均有2个突出的非配对碱基。
[0007]如本领域技术人员所知，上述RNA可根据已知的HBV病毒基因组序列按照碱基互补原则进行设计，例如，可针对HBV病毒C蛋白、X蛋白、S蛋白和P蛋白的编码区域或重叠区域进行设计，采用体外转录法和人工化学合成法，获得具有沉默HBV特定基因的3p-siRNA分子。在本发明的一个实施例中，发明人分别针对X蛋白独立编码区、S蛋白和P蛋白的编码重叠区设计并得到了两条3p-siRNA，即3p-siRNA(s/p)和3p_siRNA (x)，二者均具有抑制HBV复制的作用。[0008]本发明目的3p_siRNA分子的突出优点体现在:⑴特异性:基于RNA干扰机制，特异性沉默HBV基因组目的区域，有效抑制HBV复制，并且克服了基因沉默中的“脱靶”效应。
(2)高效性:该分子具有双重功能，既可以特异性沉默HBV基因，又具有RIG-1依赖的激活宿主抗病毒天然免疫反应功能，共同实现抑制HBV复制的目的。(3)安全性:在使用浓度为IOOnM时对H印G2.2.15细胞无显著毒性，仅在500nM时对H印G2.2.15细胞表现出一定毒性。
[0009]本发明提供的3p_siRNA可用于治疗HBV感染引起的相关疾病，例如，可用于制备治疗HBV感染的药物组合物，包括临床使用的片剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂、胶囊、滴丸、颗粒剂和其它适宜的剂型；也可与其他治疗HBV感染药物合用，以期增强疗效、降低毒性或延缓抗药性等。
【专利附图】
【附图说明】:
[0010]图1为3p-siRNA结构示意图。
[0011]图2为体外转录方法生成目的3p_siRNA的流程，以3p_siRNA (s/p)为例。
[0012]图3 为 3p-siRNA(s/p)对 H印G2.2.15 细胞的毒性(3p_siRNA 转染 96 小时)。
[0013]图4 为 3p-siRNA(s/p)激活 RIG-1 介导的 IFN 通路(A:293T 细胞，3p_siRNA 转染24 小时；B:HepG2.2.15 细胞，3p_siRNA 转染 24 小时；C:HepG2.2.15 细胞，3p_siRNA 活化RIG-1 介导的 ISRE 表达；D:HepG2.2.15 细胞，CIAP+3p_siRNA 未激活 RIG-1 介导的 IFN 通路)。
[0014]图5 为 3p-siRNA(s/p)在不同时间对 HBsAg、HBeAg 抑制率(A、B:48 小时；C、D:96小时;E、F:144小时)。
[0015]图6 为不同剂量 3p-siRNA(s/p)对HBsAg、HBeAg抑制率(3p_siRNA转染 48 小时)。
[0016]图7 为 3p-siRNA(s/p)和 3p_siRNA(x)对 HBsAg、HBeAg 抑制率(3p_siRNA 转染 48小时)。
【具体实施方式】:
[0017]一、3p_siRNA的序列设计与体外合成:
[0018]首先，分别选取X蛋白独立编码区、S蛋白和P蛋白的编码重叠区序列设计并化学合成DNA模板(5，段包含T7启动子)，然后分别用双链RNA正义链和反义链的DNA模板转录生成两条单链RNA。正义链和反义链模板5’末端突出的鸟嘌呤有利于T7 RNA聚合酶的转录。然后混合这两个反应体系孵育过夜，退火形成双链RNA。用DNAse-1 (Epicenter)消化DNA模板，接着用酚/氯仿抽提去除额外的盐和NTPs，醋酸钠和冷乙醇沉底，70%乙醇漂洗后TEBuffer溶解沉底。如图2所示。
[0019]使用碱性磷酸酶(CIAP，TaKaRa)去除3p_siRNA 5’末端的5’ -PPP基团，生成siRNA作为对照，根据以下方法完成:2ug体外转录的3p-siRNA用6U CIAP, 40URnase inhibitor 在 CIAP Buffer 中 50 °C,处理 60min,其中 CIAP Buffer 成分是:500mMTris-HCl (ph9.0)和IOmMMgCl2。接着用苯酚/氯仿抽提，醋酸钠和冷乙醇沉底，70%乙醇漂洗后TE Buffer溶解沉底。
[0020]二、通过以下实例对本发明所述药物3p_siRNA的细胞水平毒性、对RIG-1介导IFN通路的影响、对HBeAg、HBsAg的抑制率以及作用特征进行评价，但不限于以下实例。所用生物实验主要包括:细胞培养、MTT实验、质粒转染、双荧光素酶报告基因分析和ELISA实验，具体实施过程如下:[0021]实施例一:3p-siRNA(s/p)的细胞水平毒性评价
[0022]1.H印G2.2.15 细胞培养
[0023]HepG2.2.15细胞在含10%胎牛血清及200ug/ml的DMEM培养基中，于37°C、5 %C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将H印G2.2.15细胞接种96孔板(I X IO4细胞/孔)，继续培养。
[0024]2.3p_siRNA 转染
[0025]接种至96孔板内的细胞培养24小时，待长至40_60%细胞汇合后，在无G418状态下，采用转染试剂jetPRME并参照说明书操作进行转染3p-siRNA(IOOnM)，6小时后换为正常细胞培养液(含10% FBS的DMEM细胞培养液)，37°C、5% CO2继续培养。
[0026]3.MTT 检测
[0027]按照上述方法转染3p-siRNA，浓度分别为IOOnM和500nM并设细胞对照，每浓度设立五个复孔，转染体积为lOOul。转染96小时后，参照MTT使用说明书，每孔加入MTT IOul,避光培养4小时后加入formazan溶解液，37°C孵育4小时，经多标记酶联免疫检测仪测量570nm吸光度值。同时，在转染3p_siRNA后在倒置显微镜下每日观察细胞形态变化情况。
[0028]4.结果
[0029]在使用浓度为IOOnM时，所述3p_siRNA对H印G2.2.15细胞无显著毒性，在500nM时对!fepG2.2.15细胞表现出一定毒性。如图3所示。
[0030]实施例二:3p-siRNA (s/p)对RIG-1介导干扰素通路的激活作用
[0031]1.293T细胞和H印G2.2.15细胞培养
[0032]细胞在含10%胎牛血清及200ug/ml的DMEM培养基中，于37°C、5% C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将细胞接种于含有无G418、10% FBS、DMEM培养基的24孔板(3 X IO6细胞/孔)，继续培养过夜。
[0033]2.3p_siRNA 转染
[0034]接种至24孔板内的细胞培养24小时，待长至40_60%细胞汇合后，在无血清状态下，采用转染试剂jetPRME并参照说明书操作进行转染3p-siRNA(IOOnM)，6小时后换为正常细胞培养液(含10% FBS的DMEM细胞培养液)，37°C，5% CO2继续培养。
[0035]3.双荧光素酶报告基因分析法检测干扰素通路激活及ISRE表达
[0036]将IFN-β荧光素酶报告基因、干扰素刺激应答元件(IRSE)荧光素酶报告基因分别与Flag-hRIG-1共同转染HEK293T和H印G2.2.15细胞，同时转入海肾虫荧光素酶报告基因作为内参；转染24小时后，用3?-^8熟、(:^^处理生成的&8熟或？017(1:0转染细胞，继续培养18小时，利用双荧光素酶报告基因测定试剂盒检测荧光素酶活性。
[0037]4.结果
[0038]3p-siRNA作用24小时后能够显著激活RIG-1介导的干扰素表达，同时活化RIG-1介导的ISRE表达；而CIAP处理生成的siRNA未激活RIG-1介导的干扰素表达。如图4所
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[0039]实施例三:3p_siRNA(s/p)作用48小时、96小时及144小时对HBsAg、HBeAg的抑制率
[0040]1.HepG2.2.15 细胞培养
[0041]H印G2.2.15细胞在含10%胎牛血清及200ug/ml的DMEM培养基中，于37°C、5 %C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将H印G2.2.15细胞接种96孔板(I X IO4细胞/孔)，继续培养。
[0042]2.3p_siRNA 转染
[0043]接种至96孔板内的细胞培养24小时，待长至40_60%细胞汇合后，在无血清状态下，采用转染试剂jetPRME并参照说明书操作进行转染3p-siRNA(IOOnM)，6小时后换为正常细胞培养液(含10% FBS的DMEM细胞培养液)，37°C，5% CO2继续培养。
[0044]3.ELISA法检测细胞培养液中的HBsAg、HBeAg
[0045]分别于转染3p_siRNA48、96、144小时后收集细胞培养上清，按照HBsAg和HbeAgELISA检测试剂盒(万泰公司)说明书操作步骤检测。取50ul细胞培养液加入包被有HBsAb或HBeAb的96孔板中，每孔加入50ulHBsAg/HbeAg对应的酶标结合物，37°C孵育lh，用洗液洗板5次，依次加入显色液A 50ul、显色液B 50ul，37°C孵育15min，加入终止液50ul，在酶标仪上测定 450nm/630nm 处 Is 吸光值 A。根据 IR = (A450 M-A450 /A450?计算抑制率。
[0046]4.结果
[0047]转染3p-siRNA后48小时、96小时、144小时3p_siRNA对HBsAg和HBeAg的抑制率分别是 55%和 41.8%、3 7%和 24.3%、33.3%和 14.8% ;当共转染 RIG-1 和 3p_siRNA时，3p-siRNA 对 HBsAg 和 HBeAg 的抑制率分别是 66.3%和 53%、55.5%和 49.7%,45.6%和26.5%。3p-siRNA转染48小时后对HBV抑制率最高；与只转染3p_siRNA相比，共转染RIG-1时3p-siRNA对HBV表现出更明显的抑制活性。如图5所示。
[0048]实施例四:不同剂量(50nM、100nM、200nM)3p-siRNA(s/p)作用48 小时对 HBsAg、HBeAg的抑制率
[0049]1.HepG2.2.15 细胞培养
[0050]HepG2.2.15细胞在含10%胎牛血清及200ug/ml的DMEM培养基中，于37°C、5 %C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将H印G2.2.15细胞接种96孔板(I X IO4细胞/孔)，继续培养。
[0051]2.3p_siRNA 转染
[0052]接种至96孔板内的细胞培养24小时，待长至40_60%细胞汇合后，在无血清状态下，采用转染试剂jetPRME并参照说明书操作进行转染3p-siRNA(50nM、100nM、200nM)，6小时后换为正常细胞培养液(含10% FBS的DMEM细胞培养液)，37°C，5% CO2继续培养。
[0053]3.ELISA法检测细胞培养液中的HBsAg、HBeAg
[0054]于转染3p_siRNA48小时后收集细胞培养上清，按照HBsAg和HBeAg ELISA检测试剂盒(万泰公司)说明书操作步骤检测。取50ul细胞培养液加入包被有HBsAb或HBeAb的96孔板中，每孔加入50ulHBsAg/HbeAg对应的酶标结合物，37°C孵育Ih后，用洗液洗板5次，依次加入显色液A 50ul、显色液B 50ul，37°C孵育15min，加入终止液50ul，在酶标仪上测定450nm/630nm处Is吸光值A。根据IR = (AASOwm 4450^^)/^4505^计算抑制率。
[0055]4.结果[0056]以不同剂量(50nM、100nM、200nM)3p-siRNA对HBsAg、HBeAg的抑制作用呈明显剂量依赖性。如图6所示。
[0057]实施例四:3p-siRNA(s/p)、3p_siRNA(x)分别作用48 小时对 HBsAg、HBeAg 的抑制
率
[0058]1.HepG2.2.15 细胞培养
[0059]H印G2.2.15细胞在含10%胎牛血清及200ug/ml的DMEM培养基中，于37°C、5 %C02培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将H印G2.2.15细胞接种96孔板(I X IO4细胞/孔)，继续培养。
[0060]2.3p_siRNA 转染
[0061]接种至96孔板内的细胞培养24小时，待长至40-60%细胞汇合后，在无血清状态下，采用转染试剂jetPRIME并参照说明书操作分别进行转染3p-SiRNA(S/p)、3p-siRNA(x)(IOOnM)，6小时后换为正常细胞培养液(含10% FBS的DMEM细胞培养液)，37°C，5 % CO2继续培养。
[0062]3.ELISA法检测细胞培养液中的HBsAg、HBeAg
[0063]于转染3p_siRNA48小时后收集细胞培养上清，按照HBsAg和HBeAg ELISA检测试剂盒(万泰公司)说明书操作步骤检测。取50ul细胞培养液加入包被有HBsAb或HBeAb的96孔板中，每孔加入50ulHBsAg/HbeAg对应的酶标结合物，37°C孵育Ih后，用洗液洗板5次，依次加入显色液A 50ul、显色液B 50ul，37°C孵育15min，加入终止液50ul，在酶标仪上测定450nm/630nm处Is吸光值A。根据IR = (AASOwm 4450^^)/^4505^计算抑制率。
[0064]4.结果
[0065]3p-siRNA(s/p)、3p_siRNA(x)均可以抑制 HBsAg、HbeAg 的表达，二者的抑制作用之间不具有显著差异。如图7所示。
【权利要求】
1.一种新型高效双功能的抑制HBV复制的核酸类药物，其特征为:该核酸类药物具有通过RNAi机制特异性沉默HBV靶基因表达从而有效抑制HBV复制的特性，同时该核酸类药物具有通过RIG-1依赖机制激活宿主干扰素(IFN)表达，通过抗病毒天然免疫反应表现抗病毒效应，是一种兼备RNAi和激活宿主抗病毒天然免疫效应的双功能抗HBV新型核酸类药物。
2.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征为:其有效成分为三磷酸siRNA (3p-siRNA)，是一种双链RNA分子，每条单链的5’端带有3个磷酸基团。
3.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征为:其siRNA序列与HBV基因组编码区的特定部分(蛋白独立编码区或重叠编码区)互补，可以是5’ ppp-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUU3’或者 5’ ppp-GACCUUGAGGCAUACUUCA UU-3’ 及其它序列。
4.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征为:可以通过体外转录方法和人工化学合成方法进行大量制备。
5.权利I至4所述的任一3p-siRNA分子在制备抗HBV病毒感染药物中的应用。
【文档编号】A61K48/00GK103505742SQ201210202528
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月19日 优先权日:2012年6月19日
【发明者】陈忠斌, 邢雅玲, 陈晓娟, 闫飞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所