一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗的制作方法

专利名称：一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及汉逊酵母细胞增强HBsAg诱生Thl型免疫应答的新 型策略，具体涉及一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗。
背景技术：
研究显示，疫苗是控制乙肝传播最有效的手段之一。目前国内外使用的乙肝疫苗 主要由乙肝表面抗原(HBsAg)和佐剂两部分组成，单独乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫原性 较弱，佐剂用于增强抗原的免疫原性。目前被批准应用于临床的佐剂只有氢氧化铝(alum)， 其主要增强Th2型免疫应答，以体液免疫为主。对于HBV慢性感染者而言，实践显示，机体免疫反应不能有效清除病原体，一般认 为机体对HBV产生了免疫耐受。打破慢性HBV感染的免疫耐受状态，有效地激活机体特异 性体液免疫和细胞免疫是治疗慢性肝炎的关键之一。研究表明，Thl型免疫以较强的细胞 免疫和适度的体液免疫反应为特点，在宿主抵抗病毒、胞内菌感染方面起重要作用。因此， 研发一种安全的，能够诱生有效Thl型免疫应答的乙肝疫苗对控制乙肝具有重要的意义。TOLL样受体(TLRs)属于病原相关分子模式识别受体(PRR)，PRR识别某些病原微 生物或其产物所共有的高度保守的特定分子结构称为病原相关分子模式(PAMP)。TLRs与 PAMP相互作用，不仅能激活先天性免疫应答，而且还能促进抗原提呈细胞(APCs)识别病原 体，产生共刺激信号而启动获得性免疫反应，是联系先天免疫和获得性免疫的桥梁。现在已 经有11种不同的TLRs配体被识别，许多种TLRs配体被用作疫苗佐剂的研究，如R. 848和 CpG分别是TLR7和TLR9的配体。树突状细胞(DCs)表面表达多种TLRs，在识别病原微生物表面PAMP及基因如 CpG-ODN、单链和双链RNA方面起重要作用。激活后的DCs转向成熟阶段，MHC I、II类分子 及共刺激分子⑶40，⑶80，⑶86表达增高，并分泌IL-12、IFN- γ等细胞因子，促进NK细胞、 巨噬细胞吞噬杀伤病原体的活性，增强天然免疫应答。此时DCs抗原摄取能力大为降低，而 抗原提呈能力增强，DCs迁移至次级淋巴组织，将抗原以MHC-抗原肽形式递呈给T、B淋巴 细胞，激活特异性细胞和体液免疫反应。TLRs还可决定获得性免疫的类型，大多数TLRs配 体能够诱生Thl型获得性免疫反应。已有研究表明，酵母细胞壁有很多佐剂成分，其能够与DCs和巨噬细胞受体相互 作用，这些受体包括 TLR-2，TLR-4, TLR-6, CD14, Dectin-1, Dectin-2，DEC-205 和甘露糖 受体家族。酵母细胞被DCs吞噬以后，可以上调很多细胞表面分子的表达，包括粘附分子 (ICAM-1，CM4)，协同刺激因子(B7-1，B7-2，CD80，CD86)，MHC I 和 MHC II 类分子，并刺激细 胞因子 IL-12 的分泌(Stubbs AC,Martin KS,Nat Med2001 ；7(5) :625-9.)。临床研究表明， 酿酒酵母本身没有致病性，热灭活的重组酵母在机体中没有明显的副作用。利用热灭活的 表达肿瘤相关抗原的酿酒酵母细胞免疫小鼠能够产生针对肿瘤抗原特异性的T细胞免疫 应答和抗肿瘤活性(Bernstein MB, Vaccine2008 ；26 (4) :509-21. Wansley ΕΚ, Chakraborty Μ, Clin Cancer Res 2008 ；14(13) :4316-25.)。肿瘤相关抗原可通过 MHC I 和 MHC II 类分子交叉提呈，从而产生针对肿瘤相关抗原特异性Th和CTL介导的免疫应答。然而，酿酒 酵母表达体系中还存有不足之处，例如酿酒酵母产生的糖基化蛋白中，N-连接的聚糖可以 产生过敏反应。此外，这种酵母所用碳源有限。汉逊酵母是一种甲基营养型酵母，在汉逊酵 母表达的糖蛋白中，N-连接的聚糖不会产生过敏反应。汉逊酵母的碳源比较丰富，其蛋白 的产量比传统的酿酒酵母高，并且汉逊酵母本身没有致病性，目前尚无应用汉逊酵母细胞 增强HBsAg诱生Thl免疫应答的报道。

发明内容
本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，提供一种能增强HBsAg诱生Thl免 疫应答的新型乙肝疫苗及其实际用途。尤其涉及一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗。本发明采用热灭活的表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞(Yeast-HBsAg)作为 乙肝疫苗，其中HBsAg是疫苗的抗原部分，汉逊酵母细胞为疫苗的佐剂部分。并评价了 ^ast-HBsAg在小鼠体内诱导的特异性的体液免疫(检测血清中抗HBsAg的抗体)和细 胞免疫(HBsAg特异性的IFN-Y分泌能力和CTL活性)。结果表明，汉逊酵母细胞是一种 更加安全有效的疫苗载体和/或佐剂，以汉逊酵母细胞为HBsAg的载体和/佐剂，能在小 鼠体内产生HBsAg特异性T细胞免疫应答，从而诱生针对HBsAg的Thl免疫应答，可增强 ^ast-HBsAg在体内产生的免疫反应。所述的疫苗经动物免疫实验证实能够诱导免疫细 胞向脾脏聚集，促进DCs的成熟，此外，该疫苗不但能够在小鼠体内诱生Thl方向的免疫应 答，而且还能够增强Th2方向的免疫应答。包括总IgG，IgGl，IgGh，特异性CTL活性，抗原 特异的IFN-Y产生能力。本发明弥补了传统乙肝疫苗(以氢氧化铝作为佐剂)不能诱生 Thl型免疫应答的缺陷，有助于控制HBV的持续性感染。本发明的的目的通过下述技术方案实现1.表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞(Yeast-HBsAg)的诱导表达。
参照现有技术构建并诱导HBsAg的表达。首先，优化HBsAg密码子，采用汉逊酵母 细胞的偏爱密码子。常规PCR方法扩增HBsAg片断，用搭桥PCR法合成优化后的基因序列。 通过酶切连接，将目的基因亚克隆到多拷贝表达载体PDGXHP2. 0中，形成一个4拷贝的重组 表达质粒。将上述重组表达质粒及PDGXHP2. 0质粒阴性对照以电转化方法转化汉逊酵母细 胞ATC(^6012⑴ra3_)宿主菌，转化细胞涂于MDL平皿上，33°C孵箱培养1周，将转化菌落转 接入无氨基酵母氮源液体培养基中传代培养。最后将PCR筛选为稳定整合有外源基因的重 组菌株接入YPD培养基中33°C摇床培养，加入冻存液制成主代种子批于-70°C保存菌种。选 择生长性能较稳定的重组菌株进行MDL培养，OD值长至15 18，将其离心转接到含有 甲醇的MM培养基中经甲醇诱导72h，检测表达产物。同时制备热灭Shast-HBsAg，单独的 汉逊酵母细胞(Yeast vector)，后者作为实验的阴性对照。然后将上述2 种细胞利用PBS洗3遍，放在_20°C冰箱中保存。2. ELISA检测汉逊酵母细胞内HBsAg的表达。采用HBsAg检测试剂盒测定^ast-HBsAg内，以及分泌到细胞外的HBsiVg水平。取 Yeast vector, Yeast-HBsAg液，反复冻融，玻珠振荡，再超声裂解细胞。将^ast-HBsAg破 碎上清液及^ast-HBsAg培养上清分别加入HBsAg检测板孔中，并设阳性和阴性对照孔，空白对照孔，Yeast vector组也作为阴性对照2复孔。然后加入酶结合物每孔50 μ 1，空白对 照孔不加，混勻，封板，置37°C孵育。弃去孔内液体，用洗涤液注满每孔，静置，甩干，反复5 次，扣干。每孔加显色剂A，显色剂B，置37°C暗处lOmin。每孔加终止液。酶标仪上读取各 OD 450 值。3. Western blot鉴定并定量汉逊酵母细胞表达的HBsAg。将重组HBsAg (rHBsAg)，Yeast-HBsAg, Yeast vector 经 SDS 处理，然后热变 性，冷却，离心。取经热变性后的rHBsAg，Yeast-HBsAg, Yeast vector样品上样，其中， ^ast-HBsAg样品中含有表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞数为5X107，Yeast vector样 品中含有的汉逊酵母细胞数为5X107。rHBsAg样品中含有rHBsAg 1 μ g，每种样品3复孔， 在恒流下电泳后，以160mA的恒定电流转膜池，将转移后的PVDF膜置封闭液中4°C封闭过 夜。加入HBsAg多克隆抗体作为第一抗体，与PVDF膜37°C结合2h，然后加入HRP-羊抗鼠 IgG第二抗体，37°C作用lh，加入发光液显色，直至出现清晰条带，去离子水终止。扫描X光 片的目的条带，凝胶成像系统分析目的蛋白的表达量。4.小鼠免疫和免疫指标的检测免疫动物(见Figure 1_1，Tablel-1)取6周龄BALB/c雌鼠，随机分为5组，每组 10 只小鼠，分别利用 PBS,HBsAg,HBsAg+alum,Yeast vector，Yeast-HBsAg 免疫小鼠。先用 戊巴比妥钠麻醉后，用IOOu胰岛素注射器(购自BD公司)于双侧胫前肌进针，分别缓慢注 入 PBS 100 μ 1，每侧 50μ 1 ;2μ g HBsAg 溶于 100 μ 1 PBS，每侧 50μ 1 ;2μ g HBsAg+ΙΟΟμ g alum 溶于 100 μ 1 PBS,每侧 50 μ 1 ;2 X IO8Yeast vector 溶于 100 μ 1PBS,每侧 50 μ 1 ； 2 X IO8Yeast-HBsAg溶于100 μ 1 PBS,每侧50 μ 1。共免疫3次，每4周免疫1次，每2周采 血1次。第3次免疫1周后，收集脾脏细胞，检测脾脏细胞群变化及细胞免疫应答。眼眶后静脉丛插管采血常规小鼠静脉丛插管采血结束后，将输液针中的血液推 至离心管中，室温放置，析出血清，离心，吸取血清到离心管内，-20°C保存。每隔2周采血1 次。ELISA方法测定抗-HBs IgG, IgGl和IgG2a 用含有10%小牛血清的0. OlM pH 7. 2的PBS按一定稀释度稀释免疫血清，加到已包被HBsAg的检测板孔中，封板，37°C水浴 2小时，PBST洗涤5次。每孔加入PBS稀释的羊抗鼠IgG-HRP或IgGl-HRP或IgGh-HRP。 封板，37°C水浴孵育。PBST洗板5次。加显色剂A和显色剂B。37°C避光条件下显色，加终 止液终止显色反应，酶标仪读取OD 450值。为检测抗-HBs IgG滴度，将各组组内同一时点 小鼠血清等比例混合，作梯度稀释，用同上ELISA方法检测，结果根据如下标准判断样品 0D450/阴性对照孔0D450 > 2. 5判断为阳性，以出现阳性的最高血清稀释度为滴度。制备小鼠脾脏淋巴细胞第3次免疫后1周，每一免疫组取5只BALB/c鼠，无菌制 成脾脏单细胞悬液，计数并调整细胞浓度至4 X 107ml。预准备一无菌平皿，加入Hank’ s液 后将一尼龙网浸泡其中。每组取BALB/c鼠5只，无菌取脾脏，置于尼龙网上，将脾细胞悬液 用吸管移至离心管内，1500rpm离心。弃上清，往细胞沉淀中加ddH20，振荡，低渗裂解红细 胞，立即加入Hank’ s液，恢复溶液渗透压，离心，弃上清，用Hank’ s液洗涤细胞，离心。弃 上清，用无血清RPMI 1640培养液洗涤细胞沉淀，离心。弃上清，细胞沉淀用完全RPMI 1640 培养液悬浮并计数。调整细胞浓度至4X 106/ml。细胞表面分子检测第3次免疫后1周，收集脾脏细胞，脾脏细胞调整为52X106cells/ml. PBS 洗涤 2 遍，分别用 anti-CDllc-FITC，anti-CD80_PE，anti-CD86_PE， anti-MHCII-PE 为 DCs 染色；anti-CD3_PerCP，anti_CD4_FITC，anti_CD8_FITC 为脾脏 T 细 胞染色30分钟，然后用PBS洗涤2遍，2%多聚甲醛固定，应用FACS-callibar流式细胞仪 (BD 公司，美国)测定 008(0)11(；+)，以及表达0)80，0)86，]^^ II 的 DCs ；T 细胞(CD3+)，以 及⑶4+T，⑶8+T。用CELLQUEST软件进行分析。细胞内细胞因子染色将制得的4X 106/ml脾细胞悬液加至6孔细胞培养板，每孔 加1ml。用RPMI-1640完全培养液稀释HBsAg浓度至20 μ g/ml，每孔加1ml。细胞终浓度为 2X 106/ml，HBsAg终浓度为10 μ g/ml。同时以不加HBsiVg刺激的细胞作为对照。恒温培养箱 中(37°C,5%C02)培养4小时后，加入Brefeldin A，继续培养M小时。收集细胞，1500rpm 离心5分钟，PBS洗涤两遍，⑶3，⑶4，⑶8细胞表面因子染色30分钟，4%对聚甲醛固定20 分钟，将细胞悬浮于0. 5%的皂角酸钠中破膜30分钟，anti-IFN- y -APC染色，最后加入4% 多聚甲醛固定细胞。应用FACS-cafibar流式细胞仪(BD公司，美国)测定IFN-γ +⑶4+和 IFN- y +CD8+T细胞的百分比，CELLQUEST软件分析结果。检测细胞因子分泌将制得的4X 106/ml脾细胞悬液加至96孔细胞培养板，每孔 100 μ 1。用RPMI-1640完全培养液稀释HBsAg浓度至20 μ g/ml，每孔加100 μ 1。细胞终浓 度为2XlOVml, HBsAg终浓度为10 μ g/ml。恒温培养箱中(37°C,5% C02)培养72小时。 收集培养上清，ELISA方法测定上清中的IFN- γ，IL-4的浓度。采用晶美公司试剂盒测定。 加入细胞因子标准品(作7个倍比稀释度)或待测样品，100 μ 1每孔。用封板胶纸封住反 应孔，37°C孵箱孵育90分钟。洗板4次。加入100 μ 1辣根过氧化物酶标记抗细胞因子抗 体。封板，室温孵育60分钟。洗板4次，扣干。加入酶结合物工作液(10(^1/孔)，用封板 胶纸封住反应孔，37°C孵箱孵育30分钟，洗板4次。加显色液100 μ 1/孔，避光37°C孵育 15分钟。加入终止液100 μ 1/孔，混勻后即刻测量0D450值。在对数坐标纸上以细胞因子 标准品的OD 450值对细胞因子浓度(pg/ml)作图，画出标准曲线，根据待测样品的OD 450 值，在标准曲线上查出对应的浓度值。小鼠脾脏细胞增殖试验分别取2X105上述各组小鼠脾脏细胞接种于96孔板 (IOOul/孔)。在其他孔加入细胞标准品(作6个倍比稀释度)，各组内加入10 μ g/ml的重 组HBsAg，每个样本设3复孔，同时设只加培养液的对照孔，ConA设为阳性对照。置37°C 5 % C02培养箱中孵育72小时。各孔内加入CCK-8溶液20 μ 1，继续培养4小时，在450nm波长 下读取吸光值。在对数坐标纸上以细胞标准品的OD 450值对细胞数作图，画出标准曲线， 根据待测样品的OD 450值，在标准曲线上查出对应的细胞数。Calcein AM的CTL杀伤实验将制备的4X106/ml小鼠脾细胞加入六孔培养板 中aiil/孔。以7000cGy的、射线灭活对数生长期P815_s细胞，调整浓度为2X 105/ml制 备成刺激细胞，在上六孔培养板中加入刺激细胞anl/孔，培养3天后加入IL-2 25u/ml, 37°C 5%C02共培养6天。收集六孔板中经诱导的效应细胞，用Ficoll分离液纯化，以含 10% FCS的PF-RPMI 1640(无酚红)调整浓度调至2. 5X 106/ml，制备成效应细胞。获取对 数生长期P815-S，P815细胞，调节细胞浓度至IX 106/ml，加入calcein AM终浓度为5uM， 37°C水浴30mins，用Hank，s液洗二次，以含10% FCS的PF-RPMI1640在荧光显微镜下调 节细胞浓度至5X104/ml，制成标记好的靶细胞。在96孔培养板(圆底)中按E/T比例 50/l、25/l、12. 5/1,6. 25/1,3. 13/1,1. 56/1加入梯度稀释的效应细胞与标记好的靶细胞各6100 μ 1/孔，每个比例3复孔。自发释放组3复孔由IOOul靶细胞加100 μ 1含10% FCS的 PF-RPMI1640ο完全释放组先加3复孔IOOul靶细胞，96孔培养板37C 5% C02孵育4小时 后加入 IOOul lysis buffer(50mM硼酸钠，0. TritonX-100，PH 9. 0)，使之完全裂解。然 后板式离心机内离心3000rpmX5min，小心将上清移入新的孔中(切勿吸到细胞沉淀)，将 96孔培养板放入荧光测量仪检测上清的荧光值(FI)，激发光为485nm，发射光为538nm。杀 伤率％=(试验组的FI-自发释放的FI)/(完全释放组的FI-自发释放的FI)X100%，特 异性杀伤为P815-S的值减去相应的P815的值。随机区组数据方差分析(F检验)；两样本均数差别比较t检验。结果显示，汉逊酵母细胞在小鼠体内不但能够促进免疫细胞向脾脏聚集，而且能 促进DCs的成熟。而alum不能促进DCs的成熟。表达乙肝表面抗原的全汉逊酵母细胞 (Yeast-HBsAg)免疫小鼠能够产生较高水平的IgG，IgGl，IgG^i抗体。Yeast-HBsAg能够提 高血清IgGh/IgGl抗体的比值。HBsAg+alum免疫组虽然能够增强IgG，IgGl，IgGh抗体的 产生，但是不能提高血清IgGh/IgGl的比值。Yeast-HBsAg能够刺激小鼠脾脏细胞分泌特 异性IFN- γ和IL-4，而HBsAg+alum免疫组没有检测到IFN- γ和IL-4的分泌。Yeast-HBsAg 能够刺激脾脏⑶4+Τ及⑶8+Τ细胞分泌IFN- γ，而HBsAg+alum免疫组没有检测到IFN- γ 和IL-4的分泌。Yeast-HBsAg能够刺激脾脏细胞增殖，诱导HBsAg特异性的CTL活性。而 HBsAg+alum免疫组没有检测到脾脏细胞增殖及特异性的CTL活性。实验证实，汉逊酵母细胞能够诱导免疫细胞向脾脏聚集，促进DCs成熟。表达乙 肝表面抗原的全汉逊酵母细胞不但能够在小鼠体内产生Thl方向的免疫反应，而且能增强 Th2方向的免疫反应。Alum只能增强小鼠Th2方向的免疫应答，不能诱生Thl方向的免疫 应答。汉逊酵母细胞的佐剂效果优于alum。因此，表达乙肝表面抗原的全汉逊酵母细胞可 作为一种新型乙肝疫苗，在控制HBV感染中起着重要的作用。


图1所用动物免疫实验方案。图2Western blot鉴定汉逊酵母细胞中HBsAg的表达，其中，从左到右依次为样品Yeast vector、Yeast-HBsAg, HBsAg,结果表明，在 Yeast-HBsAg中有HBsAg的表达，其中，Yeast-HBsAg样品中含有表达乙肝表面抗原的汉逊 酵母细胞数为5 X IO7Jeast vector样品中含有的汉逊酵母细胞数为5 X 107，rHBsAg样品 中含有 rHBsAg Iyg0图3汉逊酵母细胞促进免疫细胞向脾脏聚集，其中，雌性BALB/c共免疫3次，每4周免疫1次，第3次免疫后1周，处死小鼠，取 出脾脏，研磨并裂解红细胞，脾脏细胞计数，与PBS，HBsAg，HBsAg+alum免疫的小鼠相比，利 用hast vector及^ast-HBsAg免疫过的小鼠脾脏细胞数目有明显的增加ΓΡ < 0. 01)。图4汉逊酵母细胞对小鼠脾脏DCs的影响，其中A.汉逊酵母细胞促进DCs向脾脏聚集。雌性BALB/c小鼠免疫3次，每4周 免疫1次，第3次免疫后1周，处死小鼠，取出脾脏，研磨并裂解红细胞，然后脾脏细胞计数， APC-anti-CDllc小鼠脾脏细胞染色，流式细胞仪检测DCs在脾脏细胞中的比例，结果表明， 与PBS，HBsAg, HBsAg+alum免疫的小鼠相比，利用Yeast vector及Yeast-HBsAg免疫过的小鼠脾脏数目有明显的增加ΓΡ < 0. 01)；B.汉逊酵母细胞促进DCs的成熟，利用CDllc分别和⑶80，⑶86，MHC class II 共染小鼠脾脏细胞，然后流式检测，CELLQUEST软件分析表达⑶80，⑶86，MHC class II的 DCs比例，此实验重复3次以上，结果相近；C.汉逊酵母细胞促进成熟DCs向脾脏聚集，与PBS，HBsAg, HBsAg+alum免疫的小 鼠相比，Yeast vector 及 ^ast-HBsAg 免疫的小鼠，其脾脏表达 CD80，CD86，MHC classll 的DCs绝对数目有明显的增加ΓΡ < 0. 01)。图5.汉逊酵母细胞促进T细胞向脾脏聚集，雌性BALB/c小鼠免疫3次，每4周免疫1次，第3次免疫后1周，处死小鼠，取出 脾脏，研磨并裂解红细胞，脾脏细胞计数，小鼠脾脏细胞PerCP-anti-CD3染色，流式细胞仪 检测T细胞在脾脏细胞中的比例，然后计算脾脏T细胞的数量，结果表明，与PBS，HBsAg, HBsAg+alum免疫的小鼠相比，Yeast-HBsAg免疫过的小鼠脾脏T细胞数目有明显的增加ΓΡ < 0. 01)。图6. Yeast-HBsAg在小鼠体内产生的抗体水平，A. Yeast-HBsAg增强小鼠体内IgG抗体的产生，初次免疫2周后，开始采集小鼠的 免疫血清，ELISA检测血清中2-12周的抗体水平，PBS或hast vector免疫的小鼠，没有抗 体的产生(结果没有显示)；B. Yeast-HBsA增强小鼠体内IgGl和IgG^i抗体的产生，1 5X IO3稀释初次免疫 第8周的小鼠免疫血清，ELISA法检测小鼠免疫血清中IgGl和IgGh的抗体水平，图中所 示为抗体的OD值，与HBsAg，HBsAg+alum组相比，Yeast-HBsAg免疫的小鼠血清中IgGl和 IgG2a的抗体水平有明显的升高广P < 0. 01)；C. Yeast-HBsAg 能够提高血清中 IgGh/IgGl 的比值，与 HBsAg，HBsAg+alum 组相 比，Yeast-HBsAg免疫的小鼠血清中IgGh/IgGl的比值有明显的升高(*P < 0. 05)，图7. Yeast-HBsAg刺激小鼠脾脏细胞HBsAg特异性细胞因子的分泌，初次免疫后9周，取小鼠脾脏细胞，HBsAg刺激3天后，收集细胞上清，ELISA检测 IFN- γ 和 IL-4 水平；A.小鼠脾脏细胞分泌IFN-Y的水平。Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏细胞产生较 高水平的IFN-Y ；B.小鼠脾脏细胞分泌IL-4的水平。Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏细胞产生较高 水平的IL-4。图8. Yeast-HBsAg增强小鼠脾脏T细胞产生IFN- γ，第3次免疫后1周，取小鼠脾脏细胞，HBsAg刺激，anti_CD3，anti_CD4，anti_CD8 脾脏细胞表面染色，anti-IFN-y细胞内因子染色，通过流式检测⑶4+T和⑶8+T细胞产生 HBsAg特异性IFN- γ的水平，此试验重复3次以上，所得结果相似。图9. Yeast-HBsAg刺激脾脏细胞特异性增殖，
其中，第3次免疫后1周，处死小鼠，收集脾脏细胞。HBsAg体外刺激3天后，加入 Cell Counting Kit_8溶液，检测小鼠脾脏细胞的增殖。与其他各组相比，Yeast-HBsAg免 疫小鼠的脾脏细胞发生了明显的增殖ΓΡ < 0. 01)。
图10. Yeast-HBsAg在小鼠体内诱导HBsAg特异性CTL活性，
第3次免疫后1周，处死小鼠，取其脾脏细胞，Calcein-AM释放法检测脾脏细胞 CTL活性，图中显示为在不同的效应细胞和靶细胞比例的情况下，脾脏细胞杀伤率的平均值。
具体实施例方式实施例1表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞的诱导表达及检测鉴定参照现有技术构建并诱导HBsAg的表达。首先，优化HBsAg密码子，采用汉逊酵 母细胞的偏爱密码子。常规PCR方法扩增HBsAg片断，上游引物5’-GATCTTTAAA AACAA AATGGAGAACATCACCTCTG-3，下游引物5，-CGGAATTCCTATTAGATGTACACCC-3，。用搭桥 PCR 法 合成优化后的基因序列。通过酶切连接，将目的基因亚克隆到多拷贝表达载体PDGXHP2. 0 中，形成一个4拷贝的重组表达质粒。将上述重组表达质粒及PDGXHP2. 0质粒阴性对照以 电转化方法转化汉逊酵母细胞ATC(^6012 (Ura3-)宿主菌，转化细胞涂于MDL平皿上，33°C 孵箱培养1周，将长出的转化菌落转接入IOml MDL(0. 14%无氨基酵母氮源、0. 5%硫酸铵、 2%葡萄糖)液体培养基中33°C摇床传代培养。传代过程中运用PCR方法筛选重组菌株。 最后将PCR筛选为稳定整合有外源基因的重组菌株接入YPD(1%酵母提取物、2%蛋白胨、 2%葡萄糖)培养基中33°C摇床培养，加入冻存液制成主代种子批于-70°C保存菌种。选 择生长性能较稳定的重组菌株进行MDL培养，33°C摇床培养大约Mh，OD值长至15 18， 将其离心转接到含有甲醇的MM(1%甲醇、0. 67%无氨基酵母氮源、0.5%硫酸铵)培养 基中经甲醇诱导72h，检测表达产物。同时制备热灭Shast-HBsAg，单独的汉逊酵母细胞 (Yeast vector)，后者作为实验的阴性对照。然后将上述2种细胞利用PBS 洗3遍，放在_20°C冰箱中保存。ELISA检测汉逊酵母细胞内HBsAg的表达采用HBsAg检测试剂盒测定^ast-HBsAg内，以及分泌到细胞外的HBsAg水平。 取如&8{ vector，Yeast-HBsAg液各500 μ 1，反复冻融，玻珠振荡，再超声裂解细胞。将 Yeast-HBsAg破碎上清液及^ast-HBsAg培养上清分别加入HBsAg检测板孔中，每孔加待测 样品50 μ 1，并设阳性和阴性对照各2孔，空白对照1孔，Yeast vector组也作为阴性对照2 复孔。然后加入酶结合物每孔50μ 1，空白对照孔不加，充分混勻，封板，置37°C孵育30min。 弃去孔内液体，用洗涤液注满每孔，静置20s，甩干，反复5次，扣干。每孔加显色剂A，显色 剂B各50 μ 1，置37°C暗处IOmin。每孔加终止液50 μ 1。酶标仪上读取各OD 450值。Western blot鉴定并定量汉逊酵母细胞表达的HBsAg将重组HBsAg(rHBsAg)，Yeast-HBsAg, Yeast vector 经 SDS 处理，然后热变性 10分钟，冰上冷却5分钟，1500rpm离心1分钟。取经热变性后的rHBsAg, Yeast-HBsAg, ^astvector样品各12 μ 1上样，其中，Yeast-HBsAg样品中含有表达乙肝表面抗原的汉逊 酵母细胞数为5X IO7Jeast vector样品中含有的汉逊酵母细胞数为5Χ 107。riffisiVg样品 中含有rHBsAg 1 μ g，每种样品3复孔，在恒流下电泳。电泳之后，以160mA的恒定电流转膜 池，将转移后的PVDF膜置封闭液中4°C封闭过夜。加入HBsAg多克隆抗体(1 2000)作为 第一抗体，与PVDF膜37°C结合池，然后加入HRP-羊抗鼠IgG(l 1000)第二抗体，37°C作 用lh，加入发光液显色，直至出现清晰条带，去离子水终止。扫描X光片的目的条带，凝胶成像系统分析目的蛋白的表达量。结果显示，Yeast-HBsAg破碎上清样品0D450/阴性对照孔0D450 = 18. 34 > 2. 5， 说明汉逊酵母细胞内有较多的HBsAg的表达。而^ast-HBsAg培养上清中0D450/阴性对照 孔0D450 = 3. 34 > 2. 5，说明有少量的HBsiVg分泌到细胞外。Western blot鉴定并定量汉 逊酵母细胞HBsAg的表达，结果表明，Yeast-HBsAg样品与阳性对照rHBsAg均在MKD左右 出现HBsAg特异性条带。而样品hast vector中没有出现HBsAg特异性条带(见图1_1)， 进一步确定^ast-HBsAg中有HBsAg的表达。在^ast-HBsAg组中，出现了两个HBsAg特 异性目的条带，是由HBsiVg糖基化修饰不同引起的。Western blot方法检测汉逊酵母细胞 中 HBsAg 的表达水平为每 1 X IO8 个 Yeast-HBsAg 中含有 0. 75-1. 25 μ gHBsAg。小鼠免疫和免疫指标的检测免疫动物(见Figure 1-1, Tablel-1)取6周龄BALB/c雌鼠，随机分为5组，每 组 10 只小鼠，分别利用 PBS，HBsAg，HBsAg+alum，Yeast vector，Yeast-HBsAg 免疫小鼠。先 用戊巴比妥钠(75mg/kg)麻醉后，用IOOu胰岛素注射器(购自BD公司)于双侧胫前肌进 针，分别缓慢注入 PBS 100 μ 1，每侧 50 μ 1 ；2μ g HBsAg 溶于 100 μ 1 PBS，每侧 50μ 1 ；2μ g HBsAg+100 μ g alum 溶于 100 μ 1 PBS,每侧 50 μ 1 ;2 X IO8Yeast vector 溶于 100 μ 1 PBS, 每侧50 μ 1 ;2 X IO8Yeast-HBsAg溶于100 μ 1 PBS，每侧50μ1。共免疫3次，每4周免疫1 次，每2周采血1次。第3次免疫1周后，收集脾脏细胞，检测脾脏细胞群变化及细胞免疫 应答。眼眶后静脉丛插管采血常规小鼠静脉丛插管采血结束后，将输液针中的血液推 至1. 5ml离心管中，室温放置3小时，析出血清，5000g离心20min，吸取血清到0. 5ml的离 心管内，-20°C保存。每隔2周采血1次，每次采血150μ 1-200μ 1。ELISA方法测定抗-HBs IgG、IgGl和IgG2a 用含有10%小牛血清的0. OlM pH 7.2 的PBS按一定稀释度稀释免疫血清，加到已包被HBsAg的检测板孔中，100 μ 1/孔。封板，放 湿盒于37°C水浴2小时，0. OlM pH7. 2的PBST洗涤5次。每孔加入100 μ 1用PBSl 2000 稀释的羊抗鼠IgG-HRP或IgGl-HRP或IgGh-HRP。封板，放湿盒于37°C水浴孵育1小时。 PBST洗板5次。力Π 50 μ 1显色剂A和50 μ 1显色剂B。37°C避光条件下显色15min。加 50 μ 1终止液终止显色反应，酶标仪读取OD 450值。为检测抗-HBs IgG滴度，将各组组内 同一时点小鼠血清等比例混合，作梯度稀释，用同上ELISA方法检测，结果根据如下标准判 断样品0D450/阴性对照孔0D450 > 2. 5判断为阳性，以出现阳性的最高血清稀释度为滴 度。制备小鼠脾脏淋巴细胞第3次免疫后1周，每一免疫组取5只BALB/c鼠，无菌制 成脾脏单细胞悬液，计数并调整细胞浓度至4 X 106/ml。预准备一无菌平皿，加入5mlHank’ s 液后将一尼龙网浸泡其中。每组取BALB/c鼠5只，无菌取脾脏，置于尼龙网上，将脾细胞悬 液用吸管移至IOml离心管内，1500rpm离心5min。弃上清，往细胞沉淀中加Iml ddH20，振 荡30s，低渗裂解红细胞，立即加入Hank，s液至10ml，恢复溶液渗透压，1500rpm离心5min。 弃上清，用5ml Hank's液洗涤细胞，1500rpm离心5min。弃上清，用5ml无血清RPMI 1640 培养液洗涤细胞沉淀，1500rpm离心5min。弃上清，细胞沉淀用完全RPMI 1640培养液(含 10%胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素及100 μ g/ml链霉素，0. 5mmol/L 二巯基 乙醇，lOmmol/L的HEPES)悬浮并计数。调整细胞浓度至4X 106/ml。
细胞表面分子检测第3次免疫后1周，收集脾脏细胞，脾脏细胞调整为 2X106cells/ml. PBS 洗涤 2 遍，分别用 anti-CDllc-FITC，anti-CD80_PE，anti-CD86_PE， anti-MHCII-PE 为 DCs 染色；anti-CD3_PerCP，anti_CD4_FITC，anti_CD8_FITC 为脾脏 T 细 胞染色30分钟，然后用PBS洗涤2遍，2%多聚甲醛固定，应用FACS-callibar流式细胞仪 (BD 公司，美国)测定 008(0)11(；+)，以及表达0)80，0)86，]^^ II 的 DCs ；T 细胞(CD3+)，以 及⑶4+T，⑶8+T。用CELLQUEST软件进行分析。细胞内细胞因子染色将制得的4X 106/ml脾细胞悬液加至6孔细胞培养板，每孔 加1ml。用RPMI-1640完全培养液稀释HBsAg浓度至20 μ g/ml，每孔加1ml。细胞终浓度为 2X 106/ml，HBsAg终浓度为10 μ g/ml。同时以不加HBsiVg刺激的细胞作为对照。恒温培养箱 中(37°C,5%C02)培养4小时后，加入Brefeldin A，继续培养M小时。收集细胞，1500rpm 离心5分钟，PBS洗涤两遍，⑶3，⑶4，⑶8细胞表面因子染色30分钟，4%对聚甲醛固定20 分钟，将细胞悬浮于0. 5%的皂角酸钠中破膜30分钟，anti-IFN- y -APC染色，最后加入4% 多聚甲醛固定细胞。应用FACS-cafibar流式细胞仪(BD公司，美国)测定IFN-γ +⑶4+和 IFN- y +CD8+T细胞的百分比，CELLQUEST软件分析结果。检测细胞因子分泌将制得的4X 106/ml脾细胞悬液加至96孔细胞培养板，每孔 100 μ 1。用RPMI-1640完全培养液稀释HBsAg浓度至20 μ g/ml，每孔加100 μ 1。细胞终浓 度为2XlOVml, HBsAg终浓度为10 μ g/ml0恒温培养箱中(37°C,5% C02)培养72小时。 收集培养上清，ELISA方法测定上清中的IFN- γ，IL-4的浓度。采用晶美公司试剂盒测定。 加入细胞因子标准品(作7个倍比稀释度)或待测样品，100 μ 1每孔。用封板胶纸封住反 应孔，37°C孵箱孵育90分钟。洗板4次。加入100 μ 1辣根过氧化物酶标记抗细胞因子抗 体。封板，室温孵育60分钟。洗板4次，扣干。加入酶结合物工作液(10(^1/孔)，用封板 胶纸封住反应孔，37°C孵箱孵育30分钟，洗板4次。加显色液100 μ 1/孔，避光37°C孵育 15分钟。加入终止液100 μ 1/孔，混勻后即刻测量0D450值。在对数坐标纸上以细胞因子 标准品的OD 450值对细胞因子浓度(pg/ml)作图，画出标准曲线，根据待测样品的OD 450 值，在标准曲线上查出对应的浓度值。小鼠脾脏细胞增殖试验分别取2X105上述各组小鼠脾脏细胞接种于96孔板 (IOOul/孔)。在其他孔加入细胞标准品(作6个倍比稀释度)，各组内加入10 μ g/ml的重 组HBsAg，每个样本设3复孔，同时设只加培养液的对照孔，ConA设为阳性对照。置37°C 5 % C02培养箱中孵育72小时。各孔内加入CCK-8溶液20 μ 1，继续培养4小时，在450nm波长 下读取吸光值。在对数坐标纸上以细胞标准品的OD 450值对细胞数作图，画出标准曲线， 根据待测样品的OD 450值，在标准曲线上查出对应的细胞数。Calcein AM的CTL杀伤实验将制备的4X106/ml小鼠脾细胞加入六孔培养板 中aiil/孔。以7000cGy的、射线灭活对数生长期P815_s细胞，调整浓度为2X 105/ml 制备成刺激细胞，在上六孔培养板中加入刺激细胞anl/孔，培养3天后加入IL-225u/ml， 37°C 5% C02共培养6天。收集六孔板中经诱导的效应细胞，用Ficoll分离液纯化，以含 10% FCS的PF-RPMI 1640(无酚红)调整浓度调至2. 5X 106/ml，制备成效应细胞。获取对 数生长期P815-S，P815细胞，调节细胞浓度至IX 106/ml，加入calcein AM终浓度为5uM， 37°C水浴30mins，用Hank，s液洗二次，以含10% FCS的PF-RPMI1640在荧光显微镜下调 节细胞浓度至5X104/ml，制成标记好的靶细胞。在96孔培养板(圆底)中按E/T比例50/l、25/l、12. 5/1,6. 25/1,3. 13/1,1. 56/1加入梯度稀释的效应细胞与标记好的靶细胞各 100 μ 1/孔，每个比例3复孔。自发释放组3复孔由IOOul靶细胞加100 μ 1含10% FCS的 PF-RPMI1640ο完全释放组先加3复孔IOOul靶细胞，96孔培养板37°C 5% C02孵育4小 时后加入 IOOul lysis buffer (50mM 硼酸钠，0. 1% TritonX-100, PH 9. 0)，使之完全裂解。 然后板式离心机内离心3000rpmX5min，小心将上清移入新的孔中(切勿吸到细胞沉淀)， 将96孔培养板放入荧光测量仪检测上清的荧光值(FI)，激发光为485nm，发射光为538nm。 杀伤率％=(试验组的FI-自发释放的FI)/(完全释放组的FI-自发释放的FI) X 100%， 特异性杀伤为P815-S的值减去相应的P815的值。随机区组数据方差分析(F检验)；两样本均数差别比较t检验。结果显示，汉逊酵母细胞促进免疫细胞向脾脏聚集如图1-2所示，Yeast-HBsAg, Yeast vector，HBsAg+alum免疫的小鼠，全脾脏细胞均有明显的增多。Yeast-HBsAg免疫小 鼠脾脏细胞数是HBsAg单独免疫组的5. 6倍，HBsAg+alum免疫小鼠脾脏细胞数是HBsAg单 独免疫组的2. 2倍，而HBsAg单独免疫对小鼠全脾脏细胞没有显著的影响。Yeastvector免 疫组和^ast-HBsAg免疫组的小鼠脾脏细胞数没有显著差异，说明脾脏细胞增多是汉逊酵 母细胞本身的作用。汉逊酵母细胞对小鼠脾脏DCs的影响DCs是最重要的抗原提呈细胞，其在机体免 疫应答中起着重要的作用。因此，本试验检测汉逊酵母细胞对脾脏DCs数目的影响。如图 1-3A所示，Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏DCs数量是HBsAg单独免疫组的13. 6倍。而单独 HBsAg免疫小鼠不能增加脾脏DCs数量。成熟DCs在活化T细胞中起着非常重要的作用。因此，本发明进一步检测汉逊酵 母细胞对脾脏DCs成熟的影响。⑶80，⑶86，MHC class II为成熟DCs细胞的表面标志 物，而CDllc为DCs的表面标志物。因此，用上述抗体进行脾脏细胞染色，然后流式检测， CELLQUEST软件分析结果。如图UB所示，Yeast-HBsAg能够提高小鼠脾脏细胞中表达 CD80, CD86, MHC class II 的 DCs 比例，而 HBsAg，HBsAg+alum 对小鼠脾脏 DCs 的比例没有 显著的影响。进一步研究汉逊酵母细胞对脾脏成熟DCs细胞数量的影响，如图1-3C所示，脾 脏成熟DCs的绝对数量有明显的升高。这些结果表明，汉逊酵母细胞能够促进DCs向脾脏聚 集及DCs的成熟，而alum作为佐剂则不能促进DCs的成熟。Yeast vector和kast-HBsAg 对小鼠脾脏DCs的影响没有显著性差异，表明促进DCs向小鼠脾脏聚集及DCs的成熟是汉 逊酵母本身的作用。汉逊酵母对小鼠脾脏T细胞的影响T细胞在清除病毒感染中起着重要的作用， ⑶3+为T细胞的表面标志，⑶4+Τ及⑶8+Τ为T细胞的两个亚群。本试验研究^ast-HBsAg 对脾脏T细胞及其亚群的影响。如表1-1所示，与PBS，HBsAg, HBsAg+alum免疫组相比， Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏T细胞在全脾脏中的比例下降。进一步分析T细胞亚群表明， Yeast-HBsAg免疫小鼠的脾脏⑶4+T在脾脏T细胞中的比例有显著的升高，而⑶8+T的比例 有明显的下降，⑶47⑶8+的比值升高。而HBsAg+alum对脾脏T细胞的比例没有显著的影 响。进一步研究脾脏中T细胞的绝对数量表明，虽然^ast-HBsAg免疫的小鼠脾脏T细胞 的比例下降，但脾脏T细胞的绝对数量有明显的升高。如图1-4所示，Yeast-HBsAg免疫的 小鼠脾脏T细胞是HBsAg单独免疫组的4. 4倍，HBsAg+alum组小鼠脾脏T细胞数量也有明 显的增加。Yeast vector和Yeast-HBsAg对小鼠脾脏T细胞的影响没有显著性差异，说明汉逊酵母本身能够促进T细胞向脾脏聚集，与汉逊酵母细胞内HBsAg无关。与alum相比， 汉逊酵母细胞能诱导更多的T细胞向脾脏聚集。表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞增加HBsAg特异性抗体的产生BALB/c鼠 于初次免疫(第0周)后第4，8周加强免疫，自0周开始每2周分离血清。ELISA法检测 HBsAg特异性的IgG水平及IgG亚类水平。结果如图1-5所示。就免疫效率来看，与PBS，Yeast vector免疫小鼠未能诱生抗体(结果未显示) 相比，HBsAg, HBsAg+alum, yeast-HBsAg均能够有效诱生抗体应答。在第2次免疫后2周， HBsAg, HBsAg+alum, Yeast-HBsAg免疫的小鼠针对HBsAg的抗体水平均有明显的增强 HBsAg免疫组的抗体滴度为1 15000，HBsAg+alum免疫组的抗体滴度为1 180000， Yeast-HBsAg组的抗体滴度为1 750000。初次免疫6周后，Yeast-HBsAg免疫小鼠 产生的抗体是HBsAg单独免疫小鼠产生抗体的50倍左右，alum作为佐剂产生的抗体是 HBsAg单独免疫组的12倍左右。初次免疫12周后，Yeast-HBsAg免疫组的抗体仍然维持 较高的水平。利用alum作为佐剂和^ast-HBsAg免疫小鼠均能够增强HBsAg的抗体水 平，但是^ast-HBsAg免疫小鼠体内产生的抗体水平明显高于HBsAg+alum免疫组，说明 Yeast-HBsAg增强Th2方向免疫应答的能力强于alum佐剂。就免疫应答类型来看，与单独HBsAg，HBsAg+alum免疫小鼠相比，Yeast-HBsAg 既能够增强IgG 2a抗体水平，也能够增强IgGl水平。如图所示，Yeast-HBsAg免疫小鼠 产生的IgG 2a抗体水平比alum作为佐剂，单独HBsAg免疫产生的IgG 2a高(0D值分别 HBsAg 组 0.082士0.02， HBsAg+alum 组 0.173士0.029， Yeast-HBsAg 组 0.802士0.064)。 并且，Yeast-HBsAg免疫小鼠产生的IgGl抗体水平高于alum作为佐剂，HBsAg单独免疫 组(0D 值分别 HBsAg 组 0. 409 士 0. 104，HBsAg+alum 组 0. 918 士 0. 105，Yeast-HBsAg 组 1. 538 士 0. 149)。与HBsAg，HBsAg+alum 免疫小鼠相比，Yeast-HBsAg 能够提高 IgGh/IgGl 的比值 (分别为 HBsiVg 组 0. 195，alum 组 0. 188，Yeast-HBsiVg 组 0. 522)，而 alum 不能提高 IgG2a/ IgGl的比值。表明Yeast-HBsAg在一定程度上使T细胞免疫反应偏向于Thl方向。表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞刺激Thl和Th2类细胞因子的释放为验 证^ast-HBsAg增强细胞免疫和体液免疫的能力，进一步分析了 Yeast-HBsAg刺激抗原特 异性的IFN-Y和IL-4释放能力。结果如图1-6所示。小鼠第3次免疫后1周，ELISA方法检测HBsAg刺激脾脏细胞释放的IFN- γ和 IL-4 水平。HBsAg、HBsAg+alum、Yeast vector 免疫小鼠检测不到 IFN-γ 或 IL-4 的释 放，而^ast-HBsAg免疫小鼠的脾脏能释放较多的HBsAg特异性IFN- γ (575. 8pg/ml)和 IL-4 (72. 5pg/ml)。此结果表明，Yeast-HBsAg既能够诱导Thl方向的免疫反应，也能增强 Th2方向的免疫反应。表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞增强小鼠脾脏⑶4+T和⑶8+T细胞产生 IFN- γ ⑶4+T和⑶8+T细胞在控制病毒感染中均起重要的作用，因此，检测⑶4+T和⑶8+T 产生IFN- γ的水平。如图1-7所示，Yeast-HBsAg免疫的小鼠脾脏⑶4+T或⑶8+T细胞均 有 IFN- γ 的产生，而 HBsAg 组，HBsAg+alum 组，Yeast vector 组小鼠的 CD4+T 和 CD8+T 细 胞没有产生IFN- γ。这些结果表明，Yeast-HBsAg既能够刺激⑶4+T也能够刺激⑶8+T细胞 产生HBsAg特异性的IFN- γ。
表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞刺激脾脏细胞增殖获得性免疫系统的细 胞包括T，B细胞两种，与天然免疫系统的细胞不同，其特点是抗原特异性，需经过克隆的选 择和增殖过程，有记忆性。本试验研究汉逊酵母细胞能否增强HBsAg特异性免疫细胞的活 化。取各组小鼠的脾脏细胞，HBsAg刺激3天后，检测小鼠脾脏细胞的增殖情况。如图1-8 所示，Yeast-HBsiVg免疫的小鼠脾脏细胞发生明显的增殖，HBsiVg刺激3天后，其脾脏细胞增 加了 7. 5倍左右。而HBSAg，HBsAg+alum，Yeast vector免疫小鼠的脾脏没有发生明显的增 殖。结果表明，汉逊酵母细胞能够促进针对HBsiVg免疫细胞的活化。表达乙肝表面抗原的重组汉逊酵母细胞在小鼠体内诱生CTL活性CTL在清除乙 肝病毒中起着重要的作用，它可以通过促进感染细胞凋亡来清除乙肝感染的肝细胞。在 本实验中，利用Calcein AM释放法检测小鼠脾脏细胞的CTL活性。结果如图1_9所示， HBsAg, HBsAg+alum免疫小鼠不能诱发明显的HBsAg特异性CTL活性(< 5% lysis)，而 Yeast-HBsAg则可诱发较高水平的CTL应答(5. 4% -24. 3% lysis)。在效靶比(E/T)为 50 1,25 1,12. 5 1,6.25 1 时，凋亡细胞的比例分别为 24. ，19. 30%，7. 46%， 5. 40%，随着效应细胞和靶细胞比例的增加，HBsAg特异性杀伤率也增高。而如￡1计vector 对照组不能产生CTL反应，说明^ast-HBsAg引起的CTL为HBsiVg特异性。效靶比(E/T)为 50/1 时，各组的特异性杀伤率为=Yeast-HBsiVg 组，HBsiVg 组，HBsAg+alum 组，Yeast vector组均< 5%。此结果说明，表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞能够在小鼠体内诱生 HBsAg特异性CTL活性。表1-1是免疫分组与免疫剂量。表1-2.是 ^ast-HBsAg 对 T (CD3+)细胞及其亚群 CD4+T 及 CD8+T 的影响(％ )。表 1-权利要求
1.一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗包活抗原部分和佐剂成分，其特征在于， 所述疫苗以乙肝表面抗原为抗原，以汉逊酵母细胞作为佐剂，所述的乙肝表面抗原和汉逊 酵母细胞为一个整体。
2.根据权利要求1所述的控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗，其特征在于，所述的 乙肝表面抗原表达于所述的汉逊酵母细胞内。
3.根据权利要求1或2所述的控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗，其特征在于，所述 疫苗中，乙肝表面抗原部分和汉逊酵母细胞佐剂部分作为一个整体进行免疫实验，其中的 乙肝表面抗原通过MHC I和MHC II类分子交叉提呈给T细胞，而产生针对乙肝表面抗原的 T细胞免疫应答。
4.根据权利要求1所述的控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗，其特征在于，所述疫 苗诱生Thl方向的免疫应答，增强Th2方向的免疫应答。
5.根据权利要求4所述的控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗，其特征在于，所述的 免疫应答包括总IgG，IgGh，特异性CTL活性和抗原特异的IFN-Y产生能力。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种控制乙型肝炎病毒持续性感染的疫苗。本发明利用热灭活的表达乙肝表面抗原的汉逊酵母细胞作为乙肝疫苗，其中HBsAg是疫苗的抗原部分，汉逊酵母细胞为疫苗的佐剂部分。动物免疫实验证实该疫苗能够诱导免疫细胞向脾脏聚集，促进DCs的成熟，该疫苗不但能够在小鼠体内诱生Th1方向的免疫应答，而且还能够增强Th2方向的免疫应答，包括总IgG，IgG1，IgG2a，特异性CTL活性，抗原特异的IFN-γ产生能力。本发明能弥补以氢氧化铝作为佐剂的传统乙肝疫苗不能诱生Th1型免疫应答的缺陷，有助于控制HBV的持续性感染。
文档编号A61K39/39GK102038948SQ20091019698
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月10日 优先权日2009年10月10日
发明者卞广林, 袁正宏 申请人:复旦大学