乳头状癌的肿瘤标志物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医药领域，具体的本发明设及乳头状癌的肿瘤标志物及其应用， 更具体设及TMEM255A基因及其表达产物作为肿瘤标志物在诊治乳头状癌中的应用。
【背景技术】
[0002] 甲状腺是人体重要的内分泌腺，它在机体新陈代谢方面具有重要地位，是内分泌 系统中发病率最高的器官。甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，约占全身恶性肿 瘤的1.5%。与一般恶性肿瘤好发于老年人不同，甲状腺癌多发于青壮年，平均年龄约40岁， 统计显示近年来甲状腺癌的发病率呈增高趋势。乳头状癌是指由滤泡细胞分化、具有典型 的乳头/滤泡结构及其核特征性改变的恶性上皮细胞肿瘤，从生物学特性的相似而言，此类 肿瘤包括单纯性乳头状癌和混合性甲状腺癌。此种类型临床最常见，分化程度高，恶性程度 也最轻，约占甲状腺癌的60%-80%，好发于40岁W下的年轻女性W及15岁W下的少年儿 童。随着分子生物学技术的不断进步，发现甲状腺癌的发生、演化与其它肿瘤类似，均与癌 基因和抑癌基因有关。研究显示，甲状腺滤泡细胞肿瘤的癌变过程和结肠肿瘤的癌变过程 类似，同样经历了一个多基因参与、多步骤的过程。
[0003] 肿瘤标志物是指在恶性肿瘤的发生、发展过程中，由肿瘤细胞合成并且分泌到生 物体组织或体液中，或者是宿主对体内的新生物反应而异常产生的，在组织或体液中含量 明显升高的一类活性物质。随着对肿瘤细胞反应产生人体自身细胞的正常成分，但在性质 和数量水平与正常或良性疾病时比较有显著性差异。不管是细胞、组织、还是体液或者血液 中都可能有肿瘤标志物的存在，而肿瘤标志物的存在是可W使用生物化学、免疫学或分子 生物学等方法检测出来的。随着后基因时代的到来W及分子生物学的发展，基因结构的差 异、基因功能的改变W及基因产物的表达异常与肿瘤的发生和发展存在密切的联系，癌基 因、抑癌基因W及其产物也属于肿瘤标志物。
[0004] 发明人对6例甲状腺乳头状癌(PTC)病例样本及5例正常对照进行高通量测序，通 过生物信息学方法进行筛选后备基因，挑选出TMEM255A。进一步，发明进行了扩大样本检测 发现TMEM255A与甲状腺乳头状癌具有很好的相关性，可用于制备甲状腺乳头状癌辅助诊疗 制剂，此外，还通过RNA干扰实验，寻找到几对能有效降低TMEM255A基因表达的干扰RNA，为 临床甲状腺乳头状癌的治疗提供研究基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供检测TMEM255A基因或蛋白在制备甲状腺乳头状癌诊断制 剂中的应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到基因 TMEM255A，进而通过分子细胞生物学方法验证了 TMEM255A与甲状腺乳头状癌具有很好的相 关性，可用于制备甲状腺乳头状癌辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。
[0007] 进一步，甲状腺乳头状癌的诊疗制剂包括用巧光定量PCR方法、基因忍片方法检测 甲状腺乳头状癌组织中TMEM255A基因的表达。
[0008] 巧光定量PCR法是通过巧光染料或巧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可W对产物进行分析，计算待测样品模板的 初始浓度。巧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复 性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0009] 基因忍片又称为DNA微阵列化NA microarray)，可分为S种主要类型：1)固定在聚 合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或CDNA片段，通常用同位素标记的祀 基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列， 通过与巧光标记的祀基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核巧酸探针 阵列，与巧光标记的祀基因杂交进行检测。基因忍片作为一种先进的、大规模、高通量检测 技术，应用于疾病的诊断，其优点有W下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速 简便;=是可同时检测多种疾病。
[0010] 用于巧光定量PCR方法检测甲状腺乳头状癌中TMEM255A基因的产品含有一对特异 性扩增TMEM255A基因的引物;基因忍片包括与TMEM255A基因的核酸序列杂交的探针。
[0011] 进一步，甲状腺乳头状癌的诊疗制剂包括用免疫方法检测甲状腺乳头状癌中 TMEM255A蛋白的表达。优选所述免疫检测方法检测甲状腺乳头状癌中TMEM255A蛋白表达的 为western blot和/或化ISA和/胶体金检测方法。
[0012] 酶联免疫吸附实验化LISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测I gM抗体、应用亲和素和 生物素的化ISA。化ISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶化RP)或者碱性憐酸 酶(AP)O
[0013] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，W银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作 载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涂后用胶体金标记的抗体检测相应 的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体W条带状固定在膜上，胶体金 标记试剂(抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上 后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的 抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集 在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
[0014] 进一步，检巧UTMEM255A蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体 可采用市售的TMEM255A单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括:包被TMEM255A单克隆抗体 的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涂液，酶反应终止液 等。
[001引进一步，检测TMEM255A蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，抗体可采用市售的 TMEM255A单克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤 法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗TMEM255A单克隆抗 体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0016] 本发明的目的在于提供一种检测甲状腺乳头状癌的基因检测试剂盒，试剂盒检测 基因TMEM255A，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9,下游引物 序列为SEQ ID NO. 10。
[0017] 进一步，该PC时式剂盒适合于目前存在市场上的所有类型巧光定量基因扩增仪，灵 敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0018] 进一步，上述巧光定量PC时式剂盒组分包括:特异性引物、内参引物、巧光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO.9， 下游引物序列为SEQ ID NO. 10。所述内参引物为GAPDH内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 11，下游引物序列为沈Q ID NO. 12。
[0019] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[0020] 本发明目的是提供了一种甲状腺乳头状癌蛋白检测试剂盒，检测试剂盒检测 TMEM255A蛋白。进一步的，试剂盒还包括其他检测试剂。
[0021] 本发明目的是提供了一种检测甲状腺乳头状癌的基因忍片，基因忍片包括与 TMEM255A基因的核酸序列杂交的探针。
[0022] 本发明的目的在于提供TMEM255A基因或蛋白抑制剂在制备抗甲状腺乳头状癌制 剂中的应用。
[0023] 进一步，抗甲状腺乳头状癌制剂是指可W抑制甲状腺乳头状癌细胞中TMEM255A基 因的表达的制剂。本领域人员熟知抑制基因的表达通常可W采用下述方法中的一种和/或 几种:通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰 技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的基因编码 蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活TMEM255A基因 的抑制基因、激活抑制TMEM255A基因表达的蛋白、导入抑制TMEM255A基因表达的S iRNA、激 活促进TMEM255AmRNA降解的microRNA、导入促进TMEM255A蛋白降解的分子、抑制促进 TMEM255A基因表达的因子及蛋白的表达。
[0024] RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源祀基因的mRNA 特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内 某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。S iRNA设计 完成后可W采用直接合成法或者构建SiRNA表达载体，制备好的SiRNA可W通过憐酸巧共沉 淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和POlybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体 试剂法等途径转染细胞。
[00巧]进一步，抑制TMEM255A基因表达的SiRNA序列选自下列序列中的一种