专利名称：非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物样品检测领域，涉及非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用。
背景技术：
胸水，又名胸腔积液，是临床上常见的病症之一，可因多个疾病引发。在我国，结核是第一位的病因，恶性肿瘤居病因的第二位。不同疾病引发的胸水，其应对措施和患者预后迥然不同。因此良恶性胸水的鉴别诊断具有至关重要的作用。恶性胸水是晚期肿瘤病人常见而又令人苦恼的一种并发症，469Γ64%的胸腔积液患者为恶性肿瘤所致，近来有增加的趋势。几乎所有的恶性肿瘤(除原发性脑肿瘤)均可引
起胸腔积液，在临床上引起胸水的恶性肿瘤中肺癌是占第一位的(249Γ4290，其次分别为原发灶不明的胸膜转移性腺癌(34%)、乳腺癌(239Γ2590，恶性淋巴瘤(12°/Γ24%)。肺癌病人在其病程中，约有半数患者发展成胸水。有数据显示约30%的肺癌患者最初的临床表现是胸水。恶性胸水患者总的预后不佳。近年来国内外学者都在试图寻找更为有效的检测指标以提高恶性胸水的检出率，肿瘤标志物就是其中研究的热点。肿瘤标志物(tumour marker, TM)主要是指细胞在癌变的发生、发展、浸润及转移过程中所分泌的一些活性物质，这些物质在正常人体内缺乏或含量极低。它们在释放入血的同时，也大量存在于肿瘤组织周围和因肿瘤产生的胸水中，且其浓度可能远远高于血清[7]。故检测胸水中的肿瘤标志物越来越受到临床的重视。肿瘤标志物癌胚抗原(carcinoma embryonic antigen, CEA)是一种糖蛋白，其分子量较大,存在于胚胎胃肠粘膜上皮与一些恶性病变组织的细胞表面，可见于肺癌、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤患者，其特异性不理想。当胸膜腔受到恶性肿瘤细胞侵犯时，由于快速的细胞转换，多糖蛋白质复合物，包括CEA脱落至胸腔，CEA由于分子量较大，一旦在闭合的胸腔产生，便不易进入血液循环，故不易形成被肾脏清除的抗原抗体复合物，因此，恶性胸水中CEA水平较血清出现早且更明显。细胞角质蛋白19片段(cytokeratin 19fragment, CYFRA 21_1)是利用鼠的单克隆抗体KS19和BM19-21在人体液中检测细胞角蛋白19的一个可溶性片段。主要分布于肺、食道、乳腺上皮，是非小细胞肺癌尤其是肺鳞癌的首选标志物。神经元特异性烯醇化酶(neuron specificenolase,NSE)主要存在于神经元及外周神经内分泌组织中，与小细胞肺癌(small cell lungcancer, SCLC)有关,是公认的小细胞肺癌高特异性、高灵敏性的肿瘤标志物[9]。国内外通过检测CEA、CYFRA 21-1和NSE来鉴别胸水性质的报道较多见，但其敏感性和特异性均不理想。因此，寻找诊断肺癌性胸水较为敏感和特异的指标，成为临床迫切需要解决的问题。临床上以细胞学检查和组织活检作为鉴别良恶性胸水的标准，前者虽然特异性高，但不够敏感，其阳性检出率仅为40%-50%，胸腔镜检查虽可大大提高诊断的敏感性(达90%左右)，但因损伤较大、费用高，又有一定的风险，临床应用受限。由于以上多方面原因，迄今为止，临床上仍未能有一个敏感性和特异性均较为理想的胸水肿瘤标志物。众所周知，在胸水中找到肿瘤细胞是判断恶性胸水的金标准。然而，只有当肺癌病灶浸破脏层胸膜，癌细胞脱入胸腔内，才能形成胸腔脱落癌细胞。首先，从胸膜上脱落下来的反应性间皮细胞也有腺癌细胞的一些形态特征，加之某些异形性不明显的癌细胞与反应性间皮细胞几乎无法区别。其次，由于癌细胞在积液中无组织及器官构架的束缚而自由漂浮和增生甚至经几代繁殖，失去了原来在组织中的形态特征，故单纯依靠形态学进行诊断，敏感性较低以至造成诊断结果中存在着相当数量的假阴性。细胞形态学诊断的敏感性仅为50%左右，特异性为80%。因此，建立一种科学、有效的细胞学诊断方法是提高肺癌性胸水诊断阳性率的有效途径，也是提高肺癌患者生存率与治愈率的关键。目前，利用抗肿瘤单克隆抗体研究和确定相关的抗原分子在肿瘤结构和功能活动中的有关特性，对于研究这些分子在恶性肿瘤细胞生物学行为中的作用有十分重要的意义，并在近年取得长足进展。同时利用抗肿瘤单克隆抗体检测各种体液中的肿瘤抗原用于恶性肿瘤的早期诊断也显示出诱人的前景，受到广泛关注。本实验室前期以人肺腺癌细胞株SPC-Al为抗原，免疫BALB/c小鼠，常规细胞融合，间接细胞ELISA法筛选阳性细胞克隆，得到一株高效价并稳定分泌IgGl抗人非小细胞肺癌单克隆抗体的细胞株NJ001 ；Western blot显示单抗NJOOl特异性结合的抗原相对分子质量(Mr)为70000左右，因此该蛋白被命名为SP70 ;免疫荧光法等证实单抗NJ001能特异地识别肺癌细胞系，其识别抗 原在非小细胞肺癌细胞的胞浆中和胞膜上均有表达，胞浆中表达量更丰富；免疫组化结果表明单抗NJ001与非小细胞肺癌组织有强阳性反应，而与小细胞肺癌、其他组织类型的肿瘤及正常肺组织呈弱阳性或阴性反应，因此证明了 SP70在非小细胞肺癌诊断中的特异性。通过双抗体夹心ELISA方法，对临床血清样本中的SP70抗原进行检测，证明该抗原在非小细胞肺癌的诊断中有重要的临床价值。Fuhrman C (Fuhrman C，Duche JC, Chouaid C，AbdAlsamad I，Atassi K，Monnet I，Tillement JPj Housset B. Useof tumor markers fordifferential diagnosis of mesothelioma and secondary pleuralmalignancies. ClinBiochem，2000，33(5) :405-410.)对肺癌患者血清和胸水样本中的(某些)肿瘤标志物(CEA，CYFRA 21-1，组织多肽抗原，透明质酸)同时进行检测和比较分析，结果显示胸水中的含量明显高于血清中的含量，因此，可以认为检测胸水中的肿瘤标志物是一种较好的鉴别良恶性胸水的方法。但是血清肿瘤标志物不一定能作为胸水肿瘤标志物，有文献报道(宋志军，吴广平.CA724和CA199在肺癌患者临床诊断意义.中国医药指南，2011，9 (19):18-19),CA72-4在肺癌患者血清中含量明显升高，然而，CA72-4在肺癌患者胸水中的诊断价值远远小于血清中的诊断价值。SP70作为一种组织特异性强的新肿瘤标志物，它在非小细胞肺癌患者所致胸水中是否表达尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供SP70作为非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用。本发明的另一目的是提供SP70的单克隆抗体的应用。本发明的又一目的是提供一种非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂盒。本发明的目的可通过如下技术方案实现SP70作为非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物在制备非小细胞肺癌胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。SP70的单克隆抗体在制备非小细胞肺癌所致胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。其中，所述的SP70的单克隆抗体优选保藏号为CCTCC NO C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌的单克隆抗体NJ001-1。所述的单克隆抗体NJ001-1在制备检测非小细胞肺癌所致胸水的双抗体夹心ELISA检测试剂中的应用。一种非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂盒，包含荧光标记的SP70的单克隆抗体、5%BSA、1%PBS。其中，所述的SP70的单克隆抗体优选保藏号为CCTCC NO C201172的杂交瘤细胞·株分泌的抗人非小细胞肺癌的单克隆抗体NJ001-1。所述的荧光标记的SP70的单克隆抗体优选Mix - n-StainTMCF 488A抗体标记试剂盒标记的单克隆抗体NJ001-1。一种检测非小细胞肺癌胸水脱落细胞的试剂盒，包含非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂，以及常规胸水脱落细胞HE染色检测试剂；其中所述的非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂包含荧光标记的SP70的单克隆抗体，优选包括Mix - n-Stain CF 488A抗体标记试剂盒标记的单克隆抗体NJ001-1。一种非小细胞肺癌诊断方法，利用本发明所述的检测非小细胞肺癌胸水脱落细胞的试剂盒分别通过直接免疫荧光法以及胸水脱落细胞HE染色检测待检胸水脱落细胞，若二者检测均为阳性，则说明待检胸水脱落细胞为非小细胞肺癌胸水脱落细胞。本发明的有益效果本发明通过大量实验研究发现，SP70抗原可作为由非小细胞肺癌引起的恶性胸水的一个敏感、特异的检测指标，同时检测胸水中和胸水脱落细胞上的SP70抗原，可大大提高癌性胸水诊断的敏感性和特异性。采用本发明双抗体夹心ELISA检测试剂对胸水中SP70进行检测，并用电化学发光技术对胸水中肺癌相关肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1和NSE进行同步检测和比较分析，SP70的阳性率显著高于CEA、CYFRA21-1和NSE的阳性率。SP70与CEA、CYFRA21-1和NSE相比较，具有更高的特异性。SP70在肺腺癌组中阳性率明显高于其他病理类型所致胸水。David等研究认为CEA在鉴别良恶性胸水上有较高的敏感性和特异性。但本研究数据显示，SP70作为一种新型的胸水肿瘤标志物其敏感性和特异性均明显优于CEA。SP70作为一个潜在的肺癌胸水肿瘤标志物，在癌性胸水中的阳性符合率(72. 2% )显著高于传统的HE染色检测法的阳性符合率(47. 2% )。本发明数据显示，在36例脱落细胞学诊断为阴性的患者中，其胸水SP70的ELISA检测结果均为阳性。造成这一现象的原因为操作者的取材局限性、制片技术以及病变是否典型等问题，从而出现延误诊断或漏诊的情况。与脱落细胞学检测相比，利用本发明试剂盒，对胸水SP70进行ELISA检测克服了上述缺点，可成为细胞病理学诊断的一种有价值的补充，使非小细胞肺癌所致恶性胸水的诊断敏感性大大提高。本发明通过荧光染料试剂盒对单克隆抗体NJ001进行标记，并利用该荧光标记单抗建立了直接免疫荧光检测方法对肺癌性胸水脱落细胞上的SP70抗原进行检测，研究结果显示，直接荧光法的阳性符合率为45. 2% (42/93)，HE染色法的阳性符合率为48. 4%(45/93)，两者阳性符合率无统计学差异(X 2 = 0. 19，P>0. 05)。因此，该法可成为传统HE染色脱落细胞检测技术的有力补充。国内外专家一直致力于寻找一些新的细胞诊断学方法，以弥补传统脱落细胞学检测中细胞形态不易辨别的缺点。本发明所建立的直接免疫荧光法作为一种新型的检测技术，和HE染色法相比较，在肺癌所致的胸水脱落细胞检测上，阳性率无显著差异。且克服了细胞形态不易辨别这一缺点，既使没有经验的病理医生也很容易掌握该检测技术。两种方法同时检测可使阳性率提高至54.8%，降低了漏诊率。同时，在辨别癌细胞和反应性间皮细胞方面也具有一定的优势。综上所述，利用本发明的试剂盒，将直接免疫荧光法检测肺癌胸水脱落细胞上的SP70抗原与传统的HE染色法相结合，可提高胸水脱落细胞学检查的敏感性，对诊断肺癌性胸水有重要的临床价值，具有广阔的应用前景。
图I胸水中SP70、CEA、CYFRA21-1和NSE的检测阳性率 图2不同病理类型胸水样本SP70检测结果图3胸水中SP70的ELISA检测与胸水脱落细胞HE染色检测结果图4肺癌患者胸水中SP70的ROC曲线分析图5胸水脱落细胞SP70直接荧光检测和HE染色法检测结果图6脱落细胞直接免疫荧光法检测结果(400 X ) 生物材料样品的保藏信息杂交瘤细胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO :C201172。
具体实施例方式实施例II.材料与试剂I. I 材料收集南京医科大学第一附属医院2011年7月至2012年2月收治的经病史、临床表现、CT或病理学确诊的肺癌患者胸水108例和非癌性胸水122例，癌性胸水患者中，男78例，女30例;年龄32 84岁、中位年龄65. O岁。非癌性胸水患者中，男82例，女40例；年龄58 90岁、中位年龄70. O岁。胸水患者疾病构成见表1，其中81例为有分期资料的肺癌患者，早期组(I / II期)为9例(肺腺癌6例，肺鳞癌3例)，晚期组(III / IV期)为72例(肺腺癌60例，肺鳞癌9例，小细胞肺癌3例)。表I胸水患者疾病构成(η = 230)
权利要求
1.SP70作为非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物在制备非小细胞肺癌胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。
2.SP70的单克隆抗体在制备非小细胞肺癌所致胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的SP70的单克隆抗体为保藏号为CCTCC NO C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌的单克隆抗体NJOOl-I。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的单克隆抗体NJ001-1在制备检测非小细胞肺癌所致胸水的双抗体夹心ELISA检测试剂中的应用。
5.一种非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于包含荧光标记的SP70的单克隆抗体、5%BSA、1%PBS。
6.根据权利要求5所述的直接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于所述的SP70的单克隆抗体为保藏号为CCTCC NO C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌的单克隆抗体 NJOO1-1。
7.根据权利要求5所述的直接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于所述的荧光标记的SP70的单克隆抗体为Mix - n-StainTMCF 488A抗体标记试剂盒标记的单克隆抗体NJ001-1。
8.—种检测非小细胞肺癌胸水脱落细胞的试剂盒，其特征在于包含非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂，以及常规胸水脱落细胞HE染色检测试剂；其中所述的非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂包含荧光标记的SP70的单克隆抗体，优选包括Mix - n-Stain CF 488A抗体标记试剂盒标记的单克隆抗体NJ001-1。
9.一种非小细胞肺癌诊断方法，其特征在于利用权利要求8所述的检测非小细胞肺癌胸水脱落细胞的试剂盒分别通过直接免疫荧光法以及胸水脱落细胞HE染色检测待检胸水脱落细胞，若二者检测均为阳性，则说明待检胸水脱落细胞为非小细胞肺癌胸水脱落细胞。
全文摘要
本发明属于生物样品检测领域，公开了非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用。SP70作为非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物在制备非小细胞肺癌胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。SP70的单克隆抗体在制备非小细胞肺癌所致胸水和/或胸水脱落细胞诊断试剂中的应用。一种非小细胞肺癌胸水脱落细胞的直接免疫荧光检测试剂盒，包含荧光标记的SP70的单克隆抗体、5%BSA、1%PBS。本发明通过大量实验研究发现，SP70抗原可作为由非小细胞肺癌引起的恶性胸水的一个敏感、特异的检测指标，同时检测胸水中和胸水脱落细胞上的SP70抗原，可大大提高癌性胸水诊断的敏感性和特异性。
文档编号G01N21/64GK102944681SQ20121047526
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者潘世扬, 王芳, 黄珮珺, 徐建, 杨瑞霞, 孙瑞红, 黄蕾 申请人:潘世扬