肺癌鉴定标志物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为201180054286. 6、申请日为2011年9月9日、发明名称为"肺 癌鉴定标志物"的发明申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本申请发明涉及具有糖链的肺癌鉴定标志物糖蛋白质或该糖蛋白质片段以及使 用其的判定肺癌的患病或肺癌的组织学类型的方法。
【背景技术】
[0003] 肺癌是难治性癌的代表例，位于2009年日本男性癌症死亡的第一位、女性癌症死 亡的第二位。肺癌分为约占10%的小细胞癌（肺小细胞癌）和约占90%的非小细胞癌两大 类，非小细胞癌进一步被分为腺癌（肺腺癌）（60% )、扁平上皮癌（肺扁平上皮癌）（25% ) 以及大细胞癌（肺大细胞癌）（5% )。
[0004] 肺小细胞癌由于是恶性度非常高的癌，所以在早期就存在强烈的转移倾向，由以 往的病例可知在发现时已转移到全身的可能性非常高。因此，通常即使未能确认向淋巴、其 它组织的转移，大多时也选择非手术疗法。另一方面，这种癌对化疗法、放射线的敏感性高， 所以在非手术疗法中以化疗法作为治疗中心。
[0005] 相对于此，占肺癌的大部分的肺非小细胞癌对化疗法、放射线的敏感性低，所以对 于治疗而言重要的是在较早时期发现并通过手术疗法摘除病灶。
[0006] 肺癌的检查可根据其检查目的分为如下三大类：（1)检查是否存在患有肺癌的可 能性的肺癌患病判定，（2)存在患病的可能性的情况下，确认其是肺癌并下结论的肺癌患病 确定，（3)确定为肺癌的情况下，检查其癌组织学类型以及发展程度为何种程度的肺癌发展 程度判断。
[0007] 这些检查中，通常采用如下方法：利用胸部X射线检查、CT检查进行肺野异常密 度影的确认，接着，通过支气管镜检查、使用了活组织等的活体检查试样的病理诊断，综合 判断癌种类的确定以及发展程度。然而，对于小细胞癌和非小细胞癌混合存在的病例或跨 学科领域的癌而言，有时在病理医生之间也存在鉴定结果不同的情况，还未达到能够进行 正确的确定诊断。
[0008] 另外，近年来，在癌的预后判断等中使用了肿瘤标志物。肿瘤标志物是指癌细胞生 产的物质或与癌细胞反应而细胞所生产的物质。血清中所包含的该肿瘤标志物的量可反映 肿瘤量、组织学类型，因此肿瘤标志物可成为癌判定等的鉴定子，可用于诊断的辅助、组织 学类型和发展程度的推测、治疗效果的判定、复发预测、预后的推定等。关于肺癌，现在也已 知CEA、CYFRA、NSE、ProGRP、SCC以及SLX等的几种肿瘤标志物（非专利文献1~3)。然 而，不论是哪种肿瘤标志物，均基于健康者与肺癌患者的血液中或组织中的蛋白质的表达 量的差异，即，基于表达的多寡，而通常即使在正常细胞中也进行表达，所以肺癌特异性低。 因此，存在所得的结果的可靠性和检测灵敏度低的问题。另外至今为止还未发现对于判定 肺癌属于哪种组织学类型有用的肺癌标志物。
[0009] 现有技术文献
[0010] 非专利文献
[0011]非专利文献l:MolinaR,etal.，（2005)AnticancerRes25:1773-1778.
[0012]非专利文献 2:MizuguchiS,etal.，（2007)AnnThoracSurg83:216-221.
[0013]非专利文献 3:HoldenriederS，etal·，（2008)ClinCancerRes14:7813-7821.
【发明内容】
[0014] 本申请发明的课题是开发一种并不再仅依赖于癌患者与健康者的蛋白质的表达 量的多寡而能够简单且高灵敏度地判定肺癌患病的肺癌鉴定标志物。更具体而言，课题是 开发成为肺癌患病时的指标的肺癌特异性鉴定标志物糖蛋白质及其糖蛋白质片段。
[0015] 另外，本申请发明的课题是还开发一种能够鉴定肺癌的组织学类型的肺癌鉴定标 志物。
[0016] 而且，本申请发明的课题是还开发一种在组织染色中鉴定肺癌乃至其组织学类型 的肺癌鉴定用糖链探针。
[0017] 由细胞分泌的蛋白质上的糖链的组成以及结构多样性是由数百个糖链相关基因 的表达平衡所控制，根据细胞的分化、癌的进行程度发生变动。可将该糖链结构发生变化的 糖蛋白质作为包括肿瘤标志物的疾病病情指标标志物进行利用。近年，这种以蛋白质组学 为基础的糖链相关肿瘤标志物的探索得到了发展。上述标志物探索的渠道中，首先，作为阶 段1，通过大规模的解析鉴定候补分子。接着，作为阶段2,通过定量解析，验证候补分子，缩 小候补范围。进而，作为阶段3,进行确认试验。
[0018] 本发明人为了解决上述课题，利用以上述标志物探索渠道为基础的糖蛋白质组 学，进行了肺癌鉴定标志物的探索。其结果，在血清糖蛋白质中鉴定了在肺癌培养细胞上清 液中检测到的具有肺癌特异性结构的新型糖蛋白质群或糖肽群。另外，发现可使用这些糖 蛋白质群或糖肽群来鉴定肺癌患病以及肺癌的组织学类型。本发明将基于这些见解，提供 以下的发明。
[0019] (1) -种表1或表2所示的肺癌鉴定标志物糖蛋白质，上述糖蛋白质在表1或表2 所示的糖基化位置的天冬酰胺残基上连接有糖链。
[0020] 表 1
[0021]
[0022]
[0023]
[0024]
[0025] 表2
[0026] t
t
[0027]
[0028]
[0029] i
[0030]
[0031]
[0032] (2)如⑴所述的肺癌鉴定标志物糖蛋白质，其中，上述糖链为选自伴随岩藻糖 基化修饰的糖链、高甘露糖型糖链、杂合型糖链、复合型双链糖链、几丁质、多乳糖胺以及 β1-3半乳糖表位中的一个以上的糖链。
[0033] (3)如（2)所述的肺癌鉴定标志物糖蛋白质，其用于鉴定肺小细胞癌或肺腺癌。
[0034] (4)如（3)所述的肺癌鉴定标志物糖蛋白质，其用于鉴定肺小细胞癌，其中，上述 糖蛋白质为选自神经细胞粘附分子（NCAM1)、分泌颗粒素III以及胰岛素样生长因子结合 蛋白-Ll(IGFBP-Ll)中的一个以上的糖蛋白质。
[0035] (5)如（3)所述的肺癌鉴定标志物糖蛋白质，其用于鉴定肺腺癌，其中，上述糖蛋 白质为纤粘连蛋白1。
[0036] (6) -种（1)~（5)中任一项所述的肺癌鉴定标志物糖蛋白质的片段，含有至少1 个连接有糖链的、表1或表2所示的糖基化位置的天冬酰胺残基。
[0037] (7) -种肺癌患病判定方法，其通过从由被检测者采取的试样中检测出一个以上 的在表1或表2所示的糖基化位置的天冬酰胺残基连接有糖链的表1或表2所示的肺癌鉴 定标志物糖蛋白质和/或一个以上的含有至少一个连接有糖链的表1或表2所示的糖基化 位置的天冬酰胺残基的上述糖蛋白质的片段，从而判定该被检测者患有肺癌。
[0038] (8)如（7)所述的方法，其中，用与上述糖链结合的一个以上的糖链探针检测上述 肺癌鉴定标志物糖蛋白质和/或该糖蛋白质的片段。
[0039] (9)如（8)所述的方法，其中，上述糖链探针与伴随岩藻糖基化修饰的糖链、高甘 露糖型糖链、杂合型糖链、复合型双链糖链、几丁质、多乳糖胺或β1-3半乳糖表位结合。
[0040] (10)如（8)或（9)所述的方法，其中，上述糖链探针为凝集素、抗体或噬菌体抗体。
[0041] (11)如（10)所述的方法，其中，上述凝集素为AAL、ConA、PWM或ΡΝΑ。
[0042] (12)如（11)所述的方法，其中，上述肺癌鉴定标志物糖蛋白质为神经细胞粘附分 子（NCAM1)，通过检测出与AAL的结合而将肺癌的组织学类型判定为小细胞癌。
[0043] (13)如（11)所述的方法，其中，上述肺癌鉴定标志物糖蛋白质为分泌颗粒素III， 通过检测出与AAL和/或ConA的结合而将肺癌的组织学类型判定为小细胞癌。
[0044] (14)如（11)所述的方法，其中，上述肺癌鉴定标志物糖蛋白质为胰岛素样生长因 子结合蛋白-LI(IGFBP-L1)，通过检测出与ConA和/或PWM的结合而将肺癌的组织学类型 判定为小细胞癌。
[0045] (15)如（11)所述的方法，其中，上述肺癌鉴定标志物糖蛋白质为纤粘连蛋白1，通 过检测出与AAL和/或PNA的结合而将肺癌的组织学类型判定为腺癌。
[0046] (16)如⑶~（11)中的任一项所述的方法，其中，根据上述糖链探针对上述肺癌 鉴定标志物糖蛋白质和/或该糖蛋白质的片段的糖链的结合结果以及上述糖链探针对表1 或表2所示的上述肺癌鉴定标志物糖蛋白质和/或该糖蛋白质的片段的结合形态，将肺癌 的组织学类型判定为小细胞癌或腺癌。
[0047] (17)如（7)~（16)中任一项所述的方法，其中，上述试样为体液、细胞或肺清洗 液。
[0048](18)如（17)所述的方法，其中，上述体液为血液（包括血清、血浆以及组织液）、 淋巴液、细胞的提取液、痰或胸水。
[0049] (19) -种组织染色用肺癌细胞鉴定抗体，其与在表1或表2所示的糖基化位置的 天冬酰胺残基上连接有糖链的表1或表2所示的肺癌鉴定标志物糖蛋白质和/或包含至少 一个连接有糖链的、表1或表2所示的糖基化位置的天冬酰胺残基的上述糖蛋白质片段结 合，从而鉴定肺癌。
[0050] (20)如（19)所述的抗体，其能够鉴定肺癌细胞的组织学类型。
[0051] (21)如（20)所述的抗体，其中，对上述肺癌鉴定标志物糖蛋白质为神经元正五聚 蛋白受体（neuronalpentraxinreceptor;NPR)，并且肺癌细胞的组织学类型为来源于小 细胞癌的细胞进行鉴定。
[0052] 本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国专利申请2010-209932号的说明 书和/或附图所记载的内容。
[0053] 根据本申请发明的肺癌鉴定标志物，通过检查体液、细胞或肺清洗液就能简单且 高可靠性地判断是否患有肺癌。而且，根据本申请的肺癌鉴定标志物，还能够鉴定肺癌的组 织学类型。
[0054] 并且，根据本申请发明的方法，能由体液、细胞或肺清洗液，以高于现存的肿瘤标 志物的正确确诊率且低侵袭性来判断肺癌患病以及肺癌组织学类型。
[0055] 而且，根据本申请发明的肺癌鉴定用糖链探针，能够在组织染色中鉴定肺癌乃至 其组织学类型。
【附图说明】
[0056] 图1是表示在肺小细胞癌培养细胞（Sc)和肺腺癌培养细胞（Ad)的培养上清中的 肺小细胞癌鉴定标志物糖蛋白质的表达的免疫印迹图。
[0057] 图2是表示在肺小细胞癌培养细胞（Sc)和肺腺癌培养细胞（Ad)的培养上清中的 肺腺癌鉴定标志物糖蛋白质的表达的免疫印迹图。
[0058] 图3是表示以各凝集素分馏的肺小细胞癌培养细胞（Sc)和肺腺癌培养细胞（Ad) 的培养上清中的以各自的抗肺癌鉴定标志物蛋白质抗体检测出的免疫印迹图。
[0059] 图4是表示将通过抗体（抗纤粘连蛋白1抗体）进行分馏的肺小细胞癌培养细胞 (Sc)和肺腺癌培养细胞（Ad)的培养上清中的肺癌鉴定标志物糖蛋白质（纤粘连蛋白1)， 以AAL凝集素进行检测的印迹图。
[0060] 图5是表示将通过AAL凝集素进行分馏的肺小细胞癌患者（Sc)和肺腺癌患者 (Ad)的血清中的肺癌鉴定标志物糖蛋白质（NCAM、纤粘连蛋白1)，以各自的抗肺癌鉴定标 志物糖蛋白质抗体进行检测的免疫印迹图。
[0061] 图6是表示将通过连续色谱处理血清进行分馏的肺小细胞癌患者（Sc)和肺腺癌 患者（Ad)的血清中的肺癌鉴定标志物糖蛋白质（分泌颗粒素III)，以抗体（抗分泌颗粒素