Akr1b10蛋白和用于肝硬化诊断的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种肝硬化特异性抗原醛酮还原酶lB10(Aldo_Keto Reductase 1B10，AKR1B10)，以及一种用于肝硬化的早期诊断、诊断、治疗指导、及预后判断的试剂盒。。
【背景技术】
[0002]慢性肝炎后肝硬化是指由于各种病因引起的肝脏慢性、进行性、弥漫性病变，其特点是在肝细胞坏死的基础上发生纤维化，并代之以纤维包绕的异常肝细胞结节(称之为假小叶)，导致正常肝小叶结构和血管解剖的破坏。我国肝硬化的主要病因是病毒性肝炎，尤其是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和丁型肝炎(HDV)病毒引起的慢性、长期炎症可导致肝硬化。
[0003]肝硬化是一种常见疾病，逐渐进展，晚期出现肝功能衰竭、门静脉高压和多种并发症，是严重和不可逆的肝脏疾病。肝硬化目前无有效的治疗方法。在肝硬化的早期(代偿期)，进行及时的干预，让患者避免重活动量工作，辅以饮食调节，如以高热量、高蛋白质、维生素丰富而易消化的食物为主。严禁饮酒，并限制脂肪，尤其是动物脂肪的过多摄人等，可避免或延缓其病情进展，预防晚期肝硬化及各种并发症的发生。
[0004]然而，早期肝硬化诊断比较困难，许多病理组织学证实为肝硬化的患者，常可无任何症状或仅出现非特异性的消化道症状。目前，对于肝硬化的早期诊断主要在于:①对病毒性肝炎患者严密随访观察；②对原因不明的肝大，特别是肝质地坚实、表面不光滑者，有肝病面容者，出现蜘蛛痣、肝掌及毛细血管扩张等体征者，采用包括超声、腹腔镜及肝组织活检等检查手段帮助确定性质。这些手段一则缺少特异性，二则临床操作也有实质性困难。急需更特异性的诊断或随访、追踪指标，尤其是无创性血清生物学指标。
[0005]AKR1B10蛋白是从人类原发性肿瘤组织中分离鉴定出来的。该蛋白质具有316个氨基酸，在多种人类肿瘤组织中高表达，并促进肿瘤细胞的生长与增值，在肿瘤的发生、发展中起重要作用。此前，本发明人研发了针对人类特异性抗原醛酮还原酶1B10蛋白(以下简称为AKR1B10)的特异性检测试剂盒及其抗体，以用于癌症的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。然而，经过进一步研发，发现该人类特异性抗原醛酮还原酶1B10蛋白是肝硬化的一个新的，特异性血清标记物，可用于肝硬化的早期诊断、诊断、治疗指导、及预后判断，而成就了本发明。
【发明内容】
[0006]本发明人新发现AKR1B10蛋白在肝硬化再生结节中高表达，并经细胞分泌，进入血液循环，使肝硬化患者血清中该蛋白水平升高。因此AKR1B10可以作为新的肝硬化血清标记物，可用于肝硬化的筛查、追踪、早期诊断、治疗指导和预后判断，因而成为本发明的基础。
[0007]因而针对人类肝硬化特异性抗原醛酮还原酶1B10 (Aldo-Keto Reductase 1B10，AKR1B10)蛋白，开发出一种新的，灵敏、特异、高效的诊断试剂盒，用于肝硬化的筛查、诊断、疗效判断与预后评估。
[0008]具体而言，本发明涉及如下内容:
1.一种基于人类肝硬化特异性抗原醛酮还原酶1B10 (AKR1B10)蛋白的诊断试剂盒。
[0009]2.该试剂盒可用于肝硬化的筛查、诊断、疗效判断与预后评估，其包含特异性检测AKR1B10的试剂。
[0010]3.项2所述的试剂盒，其中，所述特异性检测AKR1B10的试剂是特异性识别AKR1B10蛋白的特异性抗体；或所述特异性检测AKR1B10蛋白的试剂是特异性识别AKR1B10蛋白核酸的引物或探针:5’端:CAGAAAGCAGGACGTGGGACATC，3’端:GCACGTCGATTCGCGTCTATGAC。
[0011]
4.项2-3中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂可用于检测血清与尿液等体液，或组织样本中的AKR1B10蛋白。
[0012]5.项2-4中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含AKR1B10蛋白标准品。
[0013]6.项2-5中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒是酶联免疫法吸附测定(ELISA)试剂盒、时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)试剂盒及化学发光检测试剂盒。
[0014]7.项6所述的试剂盒，其包括:
包被有肝硬化特异性抗原AKR1B10特异性捕获抗体的检测板板；
生物素标记的另一种属来源的AKR1B10的特异性检测抗体。该捕获单克隆抗体与检测抗体均可与AKR1B10蛋白结合。
[0015]8.项7所述的试剂盒，其还包括:
包被缓冲液(1XPBS，ρΗ7.3±0.1)；
样品稀释液(1XPBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH 7.3±0.1)；
封闭液(IXPBS、3% BSA)；
洗脱液 PBST(1XPBS、0.05% Tween-20)；
Streptavidin-Eu/HRP。
[0016]9.根据项7或8的试剂盒，其中捕获抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫小鼠，并进行细胞融合，分离单克隆杂交细胞株，而制备的，特异性识别AKR1B10的单克隆抗体；检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫兔获得的纯化抗体。
[0017]10.根据项2-9中任一项所述的试剂盒，其中所述筛查、诊断、疗效判断及预后评估包括:
a)利用所述特异性检测AKR1B10的试剂测量来自受试者的生物学样品中AKR1B10蛋白的水平；
b)将a)中测得的水平与正常样品中的相应水平比较。
[0018]11.根据项10的试剂盒，其中所述样品是血清、尿液、等体液，或组织样品。
[0019]12.特异性检测AKR1B10蛋白的试剂在制备用于肝硬化筛查、早期诊断、疗效判断与预后评估的试剂盒中的用途。
[0020]13.根据项12所述的用途，其中，所述特异性检测AKR1B10的试剂是特异性识别AKR1B10蛋白的单克隆抗体，其是保藏号为CGMCC N0.9249、或CGMCC N0.9250单抗细胞株所产生的单克隆抗体。
[0021]
【附图说明】
[0022]图1.鼠源性AKR1B10单克隆抗体的特异性。此为用纯化的AKR1B10单克隆抗体进行Western blot以检测其特异性。M，蛋白分子量标记物；H460，人肺癌细胞系(表达AKR1B10) ;293T，人胚胎肾细胞系(表达AR，但不表达AKR1B10) ;AKR1B10，纯化蛋白；AR，纯化蛋白。抗AKR1B10单克隆抗体具有高特异性，与AR蛋白无交叉反应(注:AR (AldoseReductase)与AKR1B10为高度相似的同一家族蛋白)。
[0023]图2:用抗AKR1B10特异性抗体检测AKR1B10蛋白在人类肝硬化组织中的表达。此为用人类肝硬化活检组织切片进行免疫组织化学检测所得结果，表明AKR1B10蛋白在人类肝硬化组织中特异表达，并可以用AKR1B10特异性抗体检测到。
[0024]图3:时间分辨免疫荧光测定(TRFIA)试剂盒的灵敏度。其中捕获抗体来自用全长AKR1B10抗原制备的鼠源性单克隆抗体；检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫兔获得的纯化抗体。用纯化的、不同量AKR1B10蛋白作为待检样品，以确定最低检测灵敏度。
[0025]图4:正常人群和肝硬化患者血清中AKR1B10浓度。用上述TRFIA检测。
[0026]
【具体实施方式】
[0027]本发明涉及一种新发现，即AKR1B10蛋白在肝硬化再生结节中高表达，并经细胞分泌，进入血液循环，使肝硬化患者血清中该蛋白水平升高(参见图2与图4)。因此AKR1B10可以作为新的肝硬化血清标记物，可用于肝硬化的筛查、追踪、早期诊断、治疗指导和预后判断。
[0028]本发明提供的检测AKR1B10蛋白的试剂盒，包括特异性识别AKR1B10蛋白的单克隆抗体，该抗体被包被在固体载体上。
[0029]本发明基于抗AKR1B10特异性单克隆抗体，新开发出利用夹心时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)技术检测血清AKR1B10抗原的试剂盒，此试剂盒适用于肝硬化的筛查、追踪、早期诊断和指导治疗与判断预后。
[0030]本发明提供的检测AKR1B10抗原的夹心时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)试剂盒特征是，主要包括有:包被有捕获AKR1B10蛋白的鼠源性特异性单克隆抗体的时间分辨免疫荧光测定(TRFIA)板；生物素标记的检测抗体(2 μ g/ml兔抗AKR1B10抗体)。捕获抗体与检测抗体均可与AKR1B10抗原结合。
[0031]所述检测AKR1B10抗原的夹心时间分辨免疫荧光测定(TRFIA)试剂盒还包括有:包被缓冲液(1XPBS，pH7.3±0.1);样本稀释液/抗体稀释液(1 XPBS、1%BSA、0.05%NaN3，pH 7.3±0.1);封闭液(1XPBS、3% BSA);洗脱液 PBST (1 XPBS、0.05% Tween-20);辣根过氧化物酶(HRP)或Eu标记的Streptavidin ;标准品(不同浓度AKR1B10纯抗原:0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml)。
[0032]所述捕获抗体来自用全长AKR1B10抗原制备的鼠源性单克隆抗体；检测抗体来自用全长AKR1B10抗原免疫兔获得的纯化抗体。
[0033]本发明的另一个目的是提供上述试剂盒的制备方法。
[0034]—种制备上述检测AKR1B10抗原的夹心时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)试剂盒的方法，包括以下步骤:
用包被缓冲液将捕获抗体稀释成7-10 μ g/ml，在时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)板的每孔中加入100 μ 1上述抗体稀释液，4° C过夜；取出，置于37° C 30分钟；甩去液体，用PBST洗涤5次；空干，每孔加入100 μ 1封闭液，37° C 2小时；甩去液体，用PBS洗2次；在室温下，自然风干2小时；用锡箔纸