一种iv型胶原蛋白测试试剂盒及其测试方法
【专利摘要】本发明公开了一种IV型胶原蛋白的测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品、质控品，校准品，清洗浓缩液、稀释液及发光底物组成，本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有酶联免疫的技术相比，本发明具有更高的特异性，灵敏度，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠，大大降低了产品成本。
【专利说明】
-种IV型胶原蛋白测试试剂盒及其测试方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及测定血清中IV型胶原蛋白含量的试剂盒及其 测试方法。
【背景技术】
[0002] IV型胶原(Collagen Type IV，简写为CIV)是由分子交联形成的一种网状结构，它 有两个末端，7s胶原组分为IV型胶原氨基末端的四聚体，NC1为IV型胶原簇基末端的二聚 体，均参与寡聚体的形成。IV型胶原是肝基底膜的主要成分，存在于肝口静脉血管区，中央 静脉周围，沿着窦状隙分布。
[0003] IV型胶原在合成代谢过程中不需去除端肤而沉积于细胞外基质，故血中IV型胶原 的含量升高可能反映了肝血窦基底膜的更新率加快。基础和临床研究均发现血清IV型胶原 水平和肝纤维化及口脉高压程度密切相关，与肝脏炎症活动关系较小。正常肝脏的肝窦周 围无完整的基底膜结构。肝纤维化时，Disse氏腔内形成基底膜。此时，肝组织及血清中IV型 胶原含量亦相应增加，且IV型胶原含量与肝纤维化程度呈正相关。因此，测定血清中IV型胶 原含量是辅助诊断肝纤维化的一个重要指标。
[0004] 除了对肝纤维化进行辅助诊断，血清IV型胶原是判断糖尿病早期肾损害或肾小球 纤维化程度的有用指标；同时对探讨肺结核发生肺纤维化的早期诊断、W及发病机理的研 究等也具有重要意义。
[0005] 临床检测IV型胶原一般采用放射免疫分析方法、固相酶联免疫方法或时间分辨巧 光免疫分析方法。放射免疫分析法存在操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射 性污染、仪器昂贵等问题;时间分辨巧光免疫分析方法需要用稀有金属进行标记;化学发光 仅能一次发光且易受环境干扰;酶联免疫方法特异性好和灵敏性高、操作简便、试剂稳定、 对环境没有污染威胁。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间 短，操作方式简便，检测结果准备可靠的IV型胶原蛋白（IV-C0L)的测试试剂盒及其测试方 法。
[0007] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[000引一种IV型胶原蛋白检测试剂盒，包括:磁分离试剂、试剂Ri、试剂R2、清洗浓缩液和 发光底物，其中：
[0009] 所述磁分离试剂中含有标记有小鼠抗人IV-C0L的单克隆抗体的纳米磁性微球；
[0010] 所述试剂Ri中含有碱性憐酸酶标记的IV-C0L抗体；
[OOW 所述试剂R2中含有牛丫球蛋白IgG;
[0012] 所述清洗浓缩液中含有Tween-20;
[0013] 所述稀释液中含有BSA;
[0014] 所述发光底物中含有ΠΜΙΡ册S530。
[0015] 在本发明中，磁分离试剂中标记有小鼠抗人IV-〇)L的单克隆抗体的纳米磁性微球 的浓度为100~200yg/mL。
[0016] 在实施例中，标记有小鼠抗人IV-〇)L的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为132 ~167ug/mL〇
[0017] 在一些实施例中，标记有小鼠抗人IV-〇)L的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为 13aig/mL。
[0018] 在此实施例中，磁分离试剂中包括:标记有小鼠抗人IV-(X)L的单克隆抗体的纳米 磁性微球 13化g/mL;BSA V 3g/LTRIS 4.58g/X;r^Cl 6.81g/LTween20 0.96g/L ProclinSOO 0.2mL/L〇
[0019] 在另一实施例中，标记有小鼠抗人IV-〇)L的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为 167yg/mL。
[0020] 在此实施例中，磁分离试剂中包括:标记有小鼠抗人IV-(X)L的单克隆抗体的纳米 磁性微球 16化g/mL;BSA V 3g/LTRIS 4.58g/X;r^Cl 6.81g/LTween20 0.96g/L ProclinSOO 0.2mL/L〇
[0021 ] 磁分离试剂的抑值为8.0 ± 0.05。
[0022] 磁分离试剂中标记有小鼠抗人IV-(X)L的单克隆抗体的纳米磁性微球的制备方法 为：
[0023] (1)将DSS(辛二酸二班巧酷亚胺)溶于DMS0中至浓度为20mg/血，记为溶液1;将IV- C0L抗体溶于pH值为9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至浓度为2mg/ml，记为溶液2;
[0024] (2)溶液1与溶液2混合，置室溫90min，记为溶液3;
[00巧](3)将溶液3加入到Centricon-10浓缩管中，3000g离屯、30min至体积为0.5ml，记为 抗体溶液；
[0026] (4)取0.5mL磁珠经磁铁吸附2分钟后吸取上清；W抑值为9.5的0.1mol/L PB缓冲 液清洗3次；
[0027] (5)抗体溶液与磁珠混合，室溫反应4小时，保持混匀状态；
[0028] (6)加入Imol/L的Tris溶液37°C解育15分钟，获得标记的磁珠;其中Tris的加样量 为Img抗体加0.15ml Tris;
[0029] (7似抑7.2 O.lmol/L PB清洗标记的磁珠3次，获得标记有小鼠抗人IV-〇)L的单 克隆抗体的纳米磁性微球。
[0030] 本发明采用的IV-〇)L抗体为IV-〇)L的单克隆抗体，本发明对其来源不做限定，其 可为自制也可于市场购得，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的IV-(X)L单克 隆抗体来自北京菲斯特生物科技有限公司。
[0031 ] 本发明采用的磁珠为四氧化Ξ铁微球，其直径为0.01~5. Own。
[0032] 在本发明中，试剂R1中碱性憐酸酶标记的IV-C0L抗体的浓度为0.5~化g/mL。
[0033] 在实施例中，碱性憐酸酶标记的IV-C0L抗体的浓度为0.6~化g/mL。
[0034] 在一些实施例中，碱性憐酸酶标记的IV-C0L抗体的浓度为0.化g/mL。
[00巧]在此实施例中，试剂R1中包括：碱性憐酸酶标记的IV-(X)L抗体0.化g/mLBSA V 3g/L;TRIS 6.06g/l;NaCl 13.0g/l;Proclin300 0.2mL/l;MgCl2 0.05g/l;Zncl2 0.05g/L。
[0036] 在另一实施例中，碱性憐酸酶标记的IV-COL抗体的浓度为化g/mL。
[0037] 在此实施例中，试剂R1中包括:碱性憐酸酶标记的IV-(X)L抗体化g/mL;BSA V 3g/ L;TRIS 6.06g/l;NaCl 13.0g/l;Proclin300 0.2mL/l;MgCl2 0.05g/l;Zncl2 0.05g/L。
[003引试剂R1的抑值为7.4 ±0.05。
[0039] 碱性憐酸酶标记的IV-COL抗体的制备方法为：
[0040] (1)将ALP溶解于生理盐水，至浓度为2mg/mL，加入到Centricon-10浓缩管中， 300化pm离屯、大约20分钟，获得ALP溶液；
[0041 ] (2)每毫升ALP溶液加入0.2ml的0.1M化1〇4溶液，室溫下避光揽拌20分钟后，装入 透析袋中，用ImM pH值为4.4的醋酸钢缓冲液透析，4°C过夜，获得醒化ALP;
[0042] (3)每毫升加20μ1 0.2M pH值为9.5的碳酸盐缓冲液，使抑值为9.0~9.5,加入IV- C0L的IgG抗体至抗体浓度为2.5mg/mL，在0.01M碳酸盐缓冲液中，室溫避光轻轻揽拌2小时；
[0043] (4)每毫升加0.1ml 4mg/ml化肌4溶液，4°C放置2小时;然后W0.15M抑7.4PBS透 析，4°C过夜；
[0044] (5)在揽拌下逐滴加入等体积饱和硫酸锭，4°C放置1小时后，300化pm离屯、半小时， 弃上清；沉淀物用半饱和硫酸锭洗二次，最后沉淀物溶于0.15M pH值为7.4的PBS中，W 0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时；
[0045] (6) 1000化pm离屯、30分钟去除沉淀，制得碱性憐酸酶标记的IV-C0L抗体。
[0046] 在本发明中，试剂R2中包括:牛丫球蛋白IgG 0.5~化g/mMTRIS 1~2g/l;rfeCl 4 ~5g/l;防腐剂0.1 ~0.5mL/L。
[0047] 一些实施例中，牛丫 球蛋白 IgG 0.9yg/mLTRIS 1.56g/l;rfeCl 4.23g/l;防腐剂 0.2mL/L〇
[004引一些实施例中，防腐剂为Proclin300。
[0049] -些实施例中，试剂R2的抑值为7.4±0.05。
[00加]在本发明中，所述清洗浓缩液中包括:TRIS 12.54g/X;rfeCl 325.6g/l;Tween20 5g/L；Proclin300 0.2mL/L〇
[0化1 ]清洗浓缩液的pH值为7.4 ± 0.05。
[0化2] 在本发明中，所述稀释液中包括:BSA V 60g/l;rfeCl 9g/l;Proclin-300 0.5mL/ L。
[0053]在本发明中，发光底物中包括：LUMIPH0S530 250mL/LTRIS 2.35gA;rfeCl 6.41g/X;Na2S〇3 0.002g/X;P;roclin-300 0.2血/L。
[0054] 发光底物的抑值为8.0 ±0.05。
[0055] 在本发明中，本发明提供的试剂盒中还包括标准品、质控品和/或标准品；
[0056] 所述标准品、质控品和标准品中含有IV-C0L抗原和BSA V。
[0057] 所述标准品为不同浓度的IV-C0L抗原溶液，其中含有BSA V。
[005引标准品中，IV-C0L抗原的浓度分别为0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、 500ng/mL、lOOOng/mL。
[0化9] 各标准品中，BSA的浓度为6%。
[0060]所述质控品为不同浓度的IV-C0L抗原溶液，其中含有BSA V。
[0061 ] 质控品中，IV-C0L抗原的浓度分别为75ng/mL、500ng/mL。
[0062] 各质控品中，BSA的浓度为6%。
[0063] 所述校准品为不同浓度的IV-C0L抗原溶液，其中含有BSA V。
[0064] 校准品中，IV-C0L抗原的浓度分别为100ng/mL、500ng/mL。
[00化]各校准品中，BSA的浓度为6%。
[0066] 本发明提供的试剂盒适用于全自动仪器检测或半自动仪器检测，采用全自动检测 的实际和中，包括校准品。
[0067] 本发明提供的试剂盒中还包括ID卡。
[0068] 本发明提供试剂和中各试剂的比例W体积份数计为:磁分离试剂4~6份，试剂Ri 4~6份，试剂R2 4~6份，校准品4~6份，质控品1~3份，校准品1~3份，清洗浓缩液20~30 份，稀释液10~20份，发光底物25~40份。
[0069] 本发明提供的试剂盒采用本发明提供的组合物，其适用于IV-〇)L的化学发光法检 巧。，其检测灵敏度高，精密性，线性范围较广。其能够检测的物质为IV-〇)L的标准品、质控品 或校准品，血清或全血。其可用于疾病的诊断或治疗，也可仅用于科研目的的检测。
[0070] 本发明提供的试剂盒用于非疾病诊断或治疗目的IV-(X)L的磁微粒化学发光法检 测。
[0071] 本发明提供的试剂盒的使用方法，包括：
[0072] 步骤1:将待测样品与试剂R1、试剂R2、磁分离试剂混合，37 °C解育30min;
[0073] 步骤2:磁分离沉淀Imin后，弃上清液、W经稀释的清洗浓缩液清洗后，与发光底物 混合，测定发光值，根据发光值，W标准曲线法确定IV-C0L浓度。
[0074] 标准曲线采用标准品绘制，W标准品浓度为横坐标，W发光值为纵坐标，拟合曲 线，获得公式。
[00巧]步骤1中试剂R1、试剂R2、磁分离试剂的体积比为1:1:1。
[0076] 步骤2中稀释采用纯化水，稀释的比例为7倍。
[0077] 遇到高值册0K样本，W稀释液对待测样品稀释后进行检测。
[0078] 本发明的有益效果在于：
[0079] (1)本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的 反应体系，与现有技术相比，在出结果时间上较传统酶联免疫法少10-20分钟，同时抗体的 用量降低了20% W上，在提高产品性能的同时，大大降低了产品成本。
[0080] (2)本发明试剂盒中试剂R2,用于IV-〇)L的磁微粒化学发光法，使得反应过程更加 稳定可靠，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
[0081] (3)试剂盒中各组分的配比均是反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用有效 期及检测性能提供了有力保障。
[0082] (4)本发明试剂盒的精确度、灵敏度W及稳定性均优于市场同类产品，并且成本低 廉，操作简单，应用前景广阔。
[0083] 试验表明，W本发明提供的组合物对IV-C化进行检测，最低检测限可达lOng/mL， 灵敏度高。批内变异CV%封0.0 % ;批间变异CV%到5.0% ;精密性良好。标准曲线，线性系 数:r > 0.9900;线性范围：40-140ng/ml。
【具体实施方式】
[0084] 本发明公开了一种IV型胶原蛋白测试试剂盒及其测试方法，本领域技术人员可W 借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领 域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法已经通过 较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述 的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0085] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[00化]实施例1
[0087] W配制1L为例：
[008引 （1)称取Tr i S (Ξ径甲基氨基甲烧，分子式：化0CH2) 3CNH2) 1.56g和化C1 4.23g于 1L烧杯中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上 述1L容器中；
[0089] (2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分揽拌，直至完全溶解；用4M Η化或4M NaOH调ΡΗ，测量其范围在7.35-7.45之间；
[0090] (3)称取牛丫球蛋白IgG 0.9g于800ml纯化水的烧杯中；
[0091 ] (4)最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用 0.2皿滤器过滤;过滤完后，贴好标签于2-8 °C冷库胆存；
[0092] 试剂R2的配制(表1)
[0093]
[0094] 实施例2:
[00M] 本发明的一种IV型胶原蛋白（IV-C0L)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂 Ri，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液，稀释液及发光底物组成，其中：磁分离试 剂:标记有小鼠抗人IV-〇)L的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人IV-(X)L的 单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为16化g/ml;试剂Ri:含有碱性憐酸酶标记的IV-〇)L抗 体，所述碱性憐酸酶标记的IV-(X)L抗体浓度为化g/ml;试剂R2 :含有牛丫球蛋白质组分的缓 冲液;标准品，质控品和校准品：含有一定量IV-〇)L抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶 液，所述标准品的浓度为0 (SO)、30(S1)、90(S2)、180 (S3)、450(S4)、900(S5)ng/ml，所述质 控品的浓度为60，450ng/ml，所述校准品的浓度为90，450ng/ml;清洗浓缩液:含有Tween-20 和Proclin-300的缓冲液;稀释液:含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液;发光底物:金 刚烧的衍生物IUMIP册S530,所述金刚烧的衍生物IUMIP册S530的浓度为10μg/ml;
[0096] 本实施例的一种IV型胶原蛋白（IV-C0L)测试试剂盒，由下述体积比组成的：磁分 离试剂4%，试剂化4,试剂R2 4,校准品4,质控品1，校准品1，清洗浓缩液20,稀释液10,发光 底物25;
[0097] 本发明上述IV型胶原蛋白（IV-C0L)测定试剂盒的制备方法，其具体步骤如下：
[0098] 第一步:磁分离试剂的制备过程
[0099] -、磁珠缓冲液配制操作规程:配方见表2, W配制1L为例：
[0100] (1)称取Tris 4.58g和化C1 6.81g于 1L容器中，称取0.96g Tween-20于20ml容器 中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
[0101] (2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入 上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分揽拌，使试剂完全溶解；
[0102] (3)调节PH计测量其PH值；用4MHCl或4M化0H调PH，测量其PH在7.95-8.05之间 即符合要求；
[0103] (4)称取BSA W牛血清白蛋白）：3g倒入上述1L容器中；
[0104] (5)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95-8.05之间即符合要求，用0.2um滤器 过滤即得;过滤完后贴好标签于2-8 °C冷库胆存；
[0105] 磁珠缓冲液(表2)
[0106]
[0107]二、磁分离试剂的配制
[010引 （1)将l.Omg DSS(辛二酸二班巧酷亚胺)溶于50ul DMS0中，即浓度为20111邑/1^;取 2mg IV-C0L抗体溶于PH 9.5的O.lmol/L PB缓冲液中至总体积为1ml;
[0109] (2)计算DSS的投入量，按照W下公式计算：（抗体质量/16000)X10X368/Cdss)，其 中Cdss指代DSS的物质的量浓度mol/L;
[0110] (3)用移液枪吸取相应体积的DS巧日入到步骤1的抗体溶液中，置室溫90min;
[0111] (4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中，然后放入到sigma2-l化高速 冷冻离屯、机中在3000g的离屯、力下浓缩约30min至体积为0.5ml;
[0112] (5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直径在0.01-5.0皿之间，加入5ml反应杯中，放入专 用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
[0113] (6)每次加入1.5ml P朋.5 O.lmol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次； 将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室溫反应4小时，保持混匀状态；
[0114] (7)加入0.3ml Imol/L的Tris溶液37Γ15分钟，其中Tris的加样量为Img抗体加 0.15ml Tris；
[0115] (8)每次加入1.5ml PH 7.2 O.lmol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架， 去上清，重复操作3次；
[0116] (9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05 %的IV-(X)L磁分离试 剂；
[0117] (10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1:1的比例混匀，即得本发明试 剂盒中分离试剂。
[011引第二步:试剂化的制备过程
[0119] 一、试剂化稀释液配制操作规程:配方见表3, W配制1L为例：
[0120] (1)取Tris 6.06邑、化C1 13.0g、Zncl2 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl2 0.05邑 于烧瓶中；然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分揽拌，使试剂完全溶解；
[0121] (2)用4M肥l或4MNa0H调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；
[0122] (3)称取BSA V 3g倒入上述烧瓶中；
[0123] (4)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.化m滤器 过滤;过滤完后，贴好标签于2-8 °C冷库胆存；
[0124] 试剂化稀释液表3
[0125]
[0127]二、试剂Ri的配制(碱性憐酸酶(ALP)标记的小鼠抗人IV-C0L单克隆抗体）
[01巧](1)取lOmgALP加入5ml生理盐水中，加入到Centricon-lO浓缩管中，3000rpm离屯、 大约20分钟，浓缩至1毫升。
[01巧](2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaI〇4溶液，室溫下避光揽拌20分钟。
[0130] (3)将上述溶液装入透析袋中，用ImM PH4.4的醋酸钢缓冲液透析，4°C过夜。
[0131] (4)加20μl0.2MP朋.5碳酸盐缓冲液，使W上醒化ALP的PH升高到9.0~9.5，然后 立即加入2.5mg IgG抗体，在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室溫避光轻轻揽拌2小时。
[0132] (5)加0.1ml新配的4mg/ml NaB也液，混匀，再置4°C2小时。
[0133] (6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4°C过夜。
[0134] (7)在揽拌下逐滴加入等体积饱和硫酸锭，置4°C1小时。
[0135] (8)30(K)rpm离屯、半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸锭洗二次，最后沉淀物溶于 少量0.15M PH7.4的PBS中。
[0136] (9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析约5个小时，去除 锭离子后，lOOOOrpm离屯、30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入体积1/100的1M Mgcb溶液4°C保存。收集到的碱性憐酸酶(ALP)与IV-(X)L单克隆抗体的偶联物用上述酶反 应物稀释液Wl:600的体积比混合均匀，即得本发明试剂盒中试剂Ri。
[0137] 第Ξ步:试剂R2的制备
[013引试剂R2配制操作规程:配方见(表4)，W配制1L为例：
[0139] (1)称取TriS(Ξ径甲基氨基甲烧，分子式：化0CH2)3CNH2) 1.56g和化C1 4.23g于 1L烧杯中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上 述1L容器中；
[0140] (2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分揽拌，直至完全溶解；用4M Η化或4M NaOH调ΡΗ，测量其范围在7.35-7.45之间；
[0141] (3)称取牛丫球蛋白IgG 0.9g于800ml纯化水的烧杯中；
[0142] (4)最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用 0.2皿滤器过滤;过滤完后，贴好标签于2-8 °C冷库胆存；
[0143] 试剂R2的配制(表4)
[0144]
[0146] 第四步:标准品和质控品的配制：
[0147] (1)最高点：最高浓度点为X，目标点浓度为A，B，C，D，E，F，配制V体积的溶液时，需 加入原料的体积为分别为:表5
[014 引
[0149] (2)IV型胶原蛋白（IV-C0L)定量测定试剂盒IV-〇)L标准品原料配制成浓度点为0， 0.1，1，5,50, lOOng/ml;质控品配制的浓度点为0.6，50ng/ml。校准品配制的浓度点为1， 50ng/ml
[0150] (3)完全溶解后，贴好标签于2-8 °C冷库胆存；
[0151] 第五步:清洗浓缩液配制操作规程:配方见(表6)，W配制1L为例：
[0152] (1)称取Tris 12.54g和NaCl 325.6g于 1L容器中；
[0153] (2)称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
[0154] (3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后， 倒入上述1L容器中；
[0K5] (4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分揽拌，直至完全溶解；
[0156] (5)用4M肥L或4MNaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；
[0157] (6)最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用 0.2皿滤器过滤即得;过滤完后，贴好标签于2-8 °C冷库胆存；
[0158] 清洗浓缩液的配制(表6)
[0159]
[0160] 第六步:稀释液配方见(表7)，w配制IL为例：
[0161] (1)称取NaC19.0g和BSA V 60g于 1L的容器中；
[0162] (2)用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；
[0163] (3)最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2皿滤器过滤，贴好标签于2-8°C冷库胆存；
[0164] 稀释液的配制(表7)
[01 化]
[0166] 第屯步:发光底物配制操作规程:配方见(表8)，W配制1L为例：
[0167] (1)称取Tris 2.35g、化C1 6.41g、化2S〇3 0.002g和Proclin-300 0.2ml于 1L烧杯 中；
[016引（2)用量筒量取800ml纯化水于烧杯中，充分揽拌，直至完全溶解；用4M HC1或4M NaOH调PH，测量其范围在7.95-8.05之间；
[0169] (3)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95-8.05之间即符合要求，用0.化m滤器 过滤;过滤完后，加入250ml IUMIP册S530，混匀后，贴好标签于2-8°C冷库胆存；
[0170] 发光底物的配制(表8)
[0171]
[0173] 本发明一种IV型胶原蛋白（IV-COL)的测试方法，包括下列步骤：
[0174] (1)使用前，需使用试剂盒内校准品（选)进行曲线校正，并用质控品进行质量控 审IJ。测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
[0175] (2)加4份IV-C0L标准品、质控品、待测标本至对应试管底部；
[0176] (3)加4份试剂Ri至每一试管中；
[0177] (4)加4份试剂R2至每一试管中；
[0178] (5)加4份磁分离试剂至每一试管中；
[0179] (6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37°C水浴30分钟；
[0180] (7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓 慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器 底部W除去粘在管壁上的所有液滴；
[0181] (8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加26.7份稀释后的清洗液至每一试管中，置 多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠瓣出。混匀要彻 底；
[0182] (9)重复步骤6、7、6-遍；
[0183] (10)加25份底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
[0184] (11)如遇到高值册0K样本，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数 用稀释液对样品进行稀释。
[0185] 实施例3:
[0186] 本发明的一种IV型胶原蛋白（IV-COL)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂 Ri，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液，稀释液及发光底物组成，其中：磁分离试 剂:标记有小鼠抗人IV-〇)L的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人IV-(X)L的 单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为13化g/ml;试剂R1:含有碱性憐酸酶标记的IV-(X)L抗 体，所述碱性憐酸酶标记的IV-〇)L抗体浓度为0.化g/ml;试剂R2:含有牛丫球蛋白质组分的 缓冲液;标准品，质控品和校准品：含有一定量IV-〇)L抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V) 溶液，所述标准品的浓度为 0(50)、50(51)、100(52)、250(53)、500(54)、1000(55)11邑/1111，所 述质控品的浓度为75，500ng/ml，所述校准品的浓度为100，500ng/ml;清洗浓缩液:含有 Tween-20和Pro cl in-300的缓冲液;稀释液:含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液;发光 底物:金刚烧的衍生物IUMIP册S530，所述金刚烧的衍生物IUMIP册S530的浓度为10μg/ml;
[0187] 本实施例一种IV型胶原蛋白（IV-C0L)测试试剂盒，由下述体积比组成的：磁分离 试剂5.1，试剂化5.1，试剂R2 5.1，校准品5.1，质控品1.7，校准品1.7，清洗浓缩液25，稀释 液17,发光底物34;
[0188] 本实施例的测试方法，包括下列步骤：
[0189] (1)使用前，需使用试剂盒内校准品（选)进行曲线校正，并用质控品进行质量控 审IJ。测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
[0190] (2)加5.1份IV-C0L标准品、质控品、待测标本至对应试管底部；
[0191] (3)加5.1份试剂化至每一试管中；
[0192] (4)加5.1份试剂R2至每一试管中；
[0193] (5)加5.1份磁分离试剂至每一试管中；
[0194] (6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37°C水浴30分钟；
[01M] (7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓 慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器 底部W除去粘在管壁上的所有液滴；
[0196] (8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加26.7份稀释后的清洗液至每一试管中，置 多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠瓣出。混匀要彻 底；
[0197] (9)重复步骤 6、7、6-遍；
[0198] (10)加34份底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
[0199] (11)如遇到高值册0K样本，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数 用稀释液对样品进行稀释。
[0200] 本实施例采用所述的试剂盒各组分的配制方法与实施例1相同。
[0201] 实施例4:
[0202] 本发明的一种IV型胶原蛋白（IV-C0L)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂 Ri，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液，稀释液及发光底物组成，其中：磁分离试 剂:标记有小鼠抗人IV-〇)L的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人IV-(X)L的 单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为16化g/ml;试剂Ri:含有碱性憐酸酶标记的IV-〇)L抗 体，所述碱性憐酸酶标记的IV-(X)L抗体浓度为化g/ml;试剂R2:含有牛丫球蛋白质组分的缓 冲液;标准品，质控品和校准品：含有一定量IV-〇)L抗原的牛血清白蛋白组分五(BSA V)溶 液，所述标准品的浓度为 0(50)、50(51)、100(52)、250(53)、500(54)、1000(55)11邑/1111，所述 质控品的浓度为75，500ng/ml，所述校准品的浓度为100，500ng/ml;清洗浓缩液：含有 Tween-20和Pro cl in-300的缓冲液;稀释液:含有牛血清白蛋白组分五(BSA V)的溶液;发光 底物:金刚烧的衍生物IUMIP册S530，所述金刚烧的衍生物IUMIP册S530的浓度为10μg/ml;
[0203] 本实施例一种IV型胶原蛋白（IV-C0L)测试试剂盒，由下述体积比组成的：磁分离 试剂6，试剂化6，试剂R2 6，校准品6，质控品3，校准品3，清洗浓缩液30，稀释液20，发光底物 40；
[0204] 本实施例的测试方法，包括下列步骤：
[0205] (1)使用前，需使用试剂盒内校准品（选)进行曲线校正，并用质控品进行质量控 审IJ。测试结果在质控范围内方可进行样本的检测。
[0206] (2)加6份IV-C0L标准品、质控品、待测标本至对应试管底部；
[0207] (3)加6份试剂化至每一试管中；
[0208] (4)加6份试剂R2至每一试管中；
[0209] (5)加6份磁分离试剂至每一试管中；
[0210] (6)用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37°C水浴30分钟；
[0211] (7)试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓 慢的倒转分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器 底部W除去粘在管壁上的所有液滴；
[0212] (8)清洗浓缩液用纯化水稀释7倍后，加26.7份稀释后的清洗液至每一试管中，置 多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠瓣出。混匀要彻 底；
[0213] (9)重复步骤6、7、6-遍；
[0214] (10)加40份底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
[0215] (11)如遇到高值册0K样本，建议临床医师根据其余测试指标选择合适的稀释倍数 用稀释液对样品进行稀释。
[0216] 本实施例采用所述的试剂盒各组分的配制方法与实施例1相同。
[0217] 实施例5:临床试验：
[0218] 1、检测数据
[0219] 标本采自120例正常体检、供血者。样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病，半年 内无输血和大手术史，妇女不在妊娠期和哺乳期。分离血清进行检测，将测值进行统计学分 析，得出正常血清参考范围：40~13化g/ml。本数据仅供参考，不同地区、不同个体W及采用 不同方法进行检测，所测得的IV-(X)L水平也会有所不同，建议各实验室建立自己的正常值 范围。不可仅凭本方法得出的IV-〇)L值作出诊断，仅作为中间数据参考作用，应结合临床其 他资料分析结果，包括病人的具体情况和治疗状况。通过其他方法得到的样品中的IV-(X)L 浓度值与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。超出试剂盒测定范围的样本，系统将无 法给出确切的数值。如欲测定其确切的结果，建议稀释后再进行测定。本试剂盒的检测结果 仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，为达到诊断目的，此检测结果要与临 床检查、病史和其它的检查结合使用。本品可用于血清样本的测定，用于其他体液样本中 IV-C0L浓度测定的可靠性未得到充分确认。
[0220] 2、本发明试剂盒性能指标
[0221 ]分析灵敏度定义为:对20次零标准品的测定，取其2倍的平均偏差，其在标准曲线 上所对应的浓度即为分析灵敏度;分析灵敏度:最低检测限为lOng/ml;精密性:用不同浓度 的两个样本进行检测，各重复检测10次，其变异系数CV% ^ 10.0 % ;用Ξ个批号试剂盒检测 同一份样本，则Ξ批试剂盒之间的批间变异系数CV% ^ 15.0% ;线性系数:r > 0.9900;线性 范围：40-140ng/ml:
[0222] 与主要类似物的交叉反应情况(表9):
[0223]
[0224] 结果显示，本发明试剂盒具有良好的灵敏性、精密型、线性范围广，且具有良好的 抗干扰能力。
[0225] 最后说明的是，W上优选实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可W在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种IV型胶原蛋白检测试剂盒，包括:磁分离试剂、试剂Ri、试剂R2、清洗浓缩液、稀释 液和发光底物，其中： 所述磁分离试剂中含有标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球； 所述试剂办中含有碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体； 所述试剂R2中含有牛γ球蛋白IgG; 所述清洗浓缩液中含有Tween-20; 所述稀释液中含有BSA; 所述发光底物中含有IUMIPH0S530。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂中标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为100~200yg/mL。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中碱性磷酸酶标记的IV-COL 抗体的浓度为〇. 5~2yg/mL。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中牛γ球蛋白IgG 0.9yg/ mL；TRIS 1.56g/L；NaCl 4.23g/L；Proclin 0.2mL/L〇5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗浓缩液中包括:TRIS 12.54g/ L；NaCl 325.6g/L；Tween20 5g/L；Proclin300 0.2mL/L〇6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液中包括:BSA V 60g/L;NaCl 9g/L； Prod in-300 0.5mL/L〇7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光底物中包括：IUMIPH0S530 250mL/L;TRIS 2.35g/L;NaCl 6.41g/L;Na2S〇3 0.002g/L;Proclin-300 0.2mL/L。8. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括标准品、质控品和/或标准 品； 所述标准品、质控品和标准品中含有IV-COL抗原和BSA V。9. 权利要求1~8任一项所述的试剂盒用于非疾病诊断或治疗目的IV-COL的磁微粒化 学发光法检测。10. 权利要求1~8任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括： 步骤1:将待测样品与试剂R1、试剂R2、磁分离试剂混合，37 °C孵育30min; 步骤2:磁分离沉淀lmin后，弃上清液、以经稀释的清洗浓缩液清洗后，与发光底物混 合，测定发光值，根据发光值，以标准曲线法确定IV-COL浓度。
【文档编号】G01N33/68GK105823893SQ201610325782
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】朱驰
【申请人】北京豪迈生物工程有限公司