一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法
【专利摘要】一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法，涉及一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法。本发明为了解决现有技术中冰结构蛋白提取原料有限，提取工艺复杂，成本较高、提取得到的冰结构蛋白不能在冷冻食品与医学上广泛应用的问题。提取方法：一、冰球的制备，冰球的直径为2cm；二、将寒地冬小麦面粉与磷酸盐缓冲溶液混合搅拌提取然后离心；三、加入冰球冰提，然后滤出冰球自然融化；四、寒地冬小麦ISPs的复提。本发明取材于高寒冬小麦为食品源，安全性有保证；提取率为1.63％～4.56％，本发明制备的冰结构蛋白具有较强的抗冻活性。本发明适用于提取寒地冬小麦中的冰结构蛋白。
【专利说明】
一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法。【背景技术】
[0002]冰结构蛋白(ice structuring proteins，ISPs)，又称为不冻蛋白、抗冻蛋白 (antifreeze proteins，AFPs)，是一类由某些鱼类、昆虫、植物、真菌和细菌为抵抗外界环境应激反应所产生的多肽，具有阻止冰晶形成、修饰冰晶形态及抑制重结晶的能力，它具有一定的热滞活性，即能够以非依数性形式降低溶液的冰点，但对熔点的影响较小，从而使溶液的冰点与熔点之间出现差值。冰结构蛋白特有的性质保证生物在低温条件下得以生存。 2006年，我国卫生部公布冰结构蛋白可作为新型食品添加剂应用于冷藏食品中；
[0003]由于提取ISPs原料有限，大多从冷水鱼中提取，提取工艺复杂等因素，造成其成本较高、价格昂贵，没有在冷冻食品中及医学上普遍应用，对ISPs的发展造成了限制。如何制造出提取工艺简单、价格低廉的ISPs是ISPs产品开发的主要任务。植物ISPs的结构与功能较为复杂，具有低热滞性(大多约0.1?〇.5°C)和高重结晶抑制活性(高出鱼类和昆虫ISPs 约10?100倍)的特点，少量的植物ISPs就有较高的重晶抑制活性。文献中只提及过用辅助碎冰从女贞叶提取冰结构蛋白的方法，但是该方法存在不确定性和缺点，工艺复杂，需要进行冷诱导，提取物杂质多，没有对碎冰进行严格的控制，进而不能严格控制提取率或得率以及质量;女贞叶的蛋白产物都要经过低温诱导才能表达、合成和积累。在生物体内积累和消除有季节性变化。一般在夏季消失，秋季出现，经过冷驯化后冬季达到最高峰。
[0004]小麦是全世界第一大粮食作物，也是我国重要的粮食品种，在国民经济中占有重要地位。小麦根据生长习性可分为两种类型:冬小麦和春小麦。冬小麦相对春小麦来说营养期长，从营养期到生殖期生长缓慢，其间经历一个漫长的冬季低温阶段，直到春天长日照下才开花。世界上冬小麦种植的比重大于春小麦。冬小麦质量好，产量高，然而气候严寒减少了冬小麦适宜种植的地理分布区域，使农业生产力受到了很大的损失。东北地区冬季气温达到零下30°C以下，秋天种植的冬小麦要经历一个完成的寒冬，冬小麦在生长过程中抗寒的能力极强，其幼苗能够过冬，说明其幼苗中的蛋白质具有较好的抗寒能力。
【发明内容】
[0005]本发明为了解决现有技术中冰结构蛋白提取原料有限，提取工艺复杂，成本较高、 提取得到的冰结构蛋白不能在冷冻食品与医学上广泛应用的问题，提出了一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法。
[0006]本发明从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法按以下步骤进行:
[0007]—、冰球的制备
[0008]在硅胶冰格的每个冰孔位置放置玻璃球，向冰孔注蒸馏，然后置于_18°C的冰箱中冷冻，得到冰球；
[0009]所述玻璃球的直径为lcm;所述得到的冰球的直径为2cm;所述硅胶冰格为耐温为-40 °C的硅胶冰格，硅胶冰格为板状，长为24cm，宽为7.3cm，板上设置有10 X 2个球形冰孔，每个冰孔的内径为2cm;[〇〇1〇] 二、寒地冬小麦ISPs的提取
[0011]按料液比为lg: (10?30mL)将寒地冬小麦面粉与磷酸盐缓冲溶液混合，在室温条件下搅拌提取0.5?3.0h，然后用离心机离心14?16min，得到上清液；[〇〇12]所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.2?8.0,磷酸根浓度为60?140mmol/L;所述搅拌提取时采用磁力搅拌器进行，磁力搅拌器的转速为800?1000r/min;所述离心时离心机的转速为8000 ?10000r/min;[0〇13] 三、冰球提取[〇〇14]向步骤二上清液中加入步骤一制备的冰球，放入-18°C的冰箱中，冰提2?4min，此时冰球吸附冰结构蛋白达到饱和，滤出冰球并置于室温下自然融化得到提取液，滤出冰球后得到剩余的上清液;所述加入上清液的冰球量为每50mL上清液6?15个；[〇〇15] 四、寒地冬小麦ISPs的复提[〇〇16]向剩余的上清液中加入步骤一制备的冰球，重复步骤三2?4次，收集每次提取得到的提取液，即完成。此时步骤二中上清液中的ISPs基本被冰球全部吸附；
[0017]本法具备以下有益效果:
[0018]1、本发明取材于高寒冬小麦，提取的冰结构蛋白为食品源，对于应用于冷冻食品上的安全性有保证；
[0019]2、本发明寒地冬小麦ISPs冰结构蛋白的提取率为1.63%?4.56%;其中提取率为:最终得到的冰结构蛋白的质量占原料中含有的多种蛋白质的总质量的百分比。
[0020]3、将寒地冬小麦冰结构蛋白提取液进行浓缩、冷冻干燥得到寒地冬小麦冰结构蛋白冻干粉，将冻干粉复溶，对溶液进行冰晶观察，并与蒸馏水、蔗糖溶液进行对比，结果显示，寒地冬小麦冰结构蛋白溶液冰晶体积小，形态多样，具有较好的冰晶修饰特性；
[0021]4、采取差示扫描量热仪检测本发明提取的寒地冬小麦冰结构蛋白提取液的热滞活性，提取液浓度为30mg/mL，热滞活性为0.27?0.33°C，表明热滞活性显著，由此得出本发明制备的寒地冬小麦冰结构蛋白具有较强的抗冻活性；[〇〇22]5、通过冰晶观察，本发明方法制备的寒地冬小麦ISPs复溶液冰晶分布均匀，形态各异，说明其具有抗冻活性。【具体实施方式】:
[0023]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意合理组合。
[0024]【具体实施方式】一:本实施方式从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法按以下步骤进行:
[0025]一、冰球的制备
[0026]在硅胶冰格的每个冰孔位置放置玻璃球，向冰孔注蒸馏水，然后置于-18°C的冰箱中冷冻，得到冰球；[〇〇27] 二、寒地冬小麦ISPs的提取[〇〇28]按料液比为lg: (10?30mL)将寒地冬小麦面粉与磷酸盐缓冲溶液混合，在室温条件下搅拌提取0.5?3.0h，然后用离心机离心14?16min，得到上清液；
[0029] 三、冰球提取[0〇3〇]向步骤二上清液中加入步骤一制备的冰球，放入-18°c的冰箱中，冰提2?4min，此时冰球吸附冰结构蛋白达到饱和，滤出冰球并置于室温下自然融化得到提取液，滤出冰球后得到剩余的上清液；[〇〇31]四、寒地冬小麦ISPs的复提[〇〇32]向剩余的上清液中加入步骤一制备的冰球，重复步骤三2?4次，收集每次提取得到的提取液，即完成。[〇〇33]本实施方式具备以下有益效果:[〇〇34]1、本实施方式取材于高寒冬小麦，提取的冰结构蛋白为食品源，对于应用于冷冻食品上的安全性有保证；[〇〇35]2、本实施方式寒地冬小麦ISPs冰结构蛋白的提取率为1.63%?4.56%;
[0036]3、将寒地冬小麦冰结构蛋白提取液进行浓缩、冷冻干燥得到寒地冬小麦冰结构蛋白冻干粉，将冻干粉复溶，对溶液进行冰晶观察，并与蒸馏水、蔗糖溶液进行对比，结果显示，寒地冬小麦冰结构蛋白溶液冰晶体积小，形态多样，具有较好的冰晶修饰特性；
[0037]4、采取差示扫描量热仪检测本实施方式提取的寒地冬小麦冰结构蛋白提取液的热滞活性，提取液浓度为30mg/mL，热滞活性为0.27?0.33°C，表明热滞活性显著，由此得出本实施方式制备的寒地冬小麦冰结构蛋白具有较强的抗冻活性；
[0038]5、通过冰晶观察，本实施方式方法制备的寒地冬小麦I SPs复溶液冰晶分布均匀， 形态各异，说明其具有抗冻活性。
[0039]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一所述玻璃球的直径为lcm;所述得到的冰球的直径为2cm;所述硅胶冰格为耐温为-40°C的硅胶冰格，硅胶冰格为板状，长为24cm，宽为7.3cm，板上设置有10 X 2个球形冰孔，每个冰孔的内径为2cm。 其他步骤和参数与【具体实施方式】一相同。
[0040]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是:骤二所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.2?8.0，磷酸根浓度为60?140mmol/L。其他步骤和参数与【具体实施方式】一或二相同。[0041 ]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是:步骤二所述搅拌提取时采用磁力搅拌器进行，磁力搅拌器的转速为800?lOOOr/min。其他步骤和参数与【具体实施方式】一至三之一相同。
[0042]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是:步骤二所述离心时离心机的转速为8000?10000r/min。其他步骤和参数与【具体实施方式】一至四之一相同。[〇〇43]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一至五之一不同的是:步骤三所述加入上清液的冰球量为每50mL上清液6?15个。其他步骤和参数与【具体实施方式】一至五之一相同。
[0044]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一至六之一不同的是:步骤三所述加入上清液的冰球量为每50mL上清液10个。其他步骤和参数与【具体实施方式】一至六之一相同。
[0045]为验证本发明的有益效果，进行以下试验:
[0046]实施例1
[0047]本实施例从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法按以下步骤进行:
[0048]一、冰球的制备
[0049]在硅胶冰格的每个冰孔位置放置玻璃球，向冰孔注水，然后置于-18°C的冰箱中冷冻，得到冰球；
[0050]所述玻璃球的直径为lcm;所述得到的冰球的直径为2cm;所述硅胶冰格为耐温为-40 °C的硅胶冰格，硅胶冰格为板状，长为24cm，宽为7.3cm，板上设置有10 X 2个球形冰孔，每个冰孔的内径为2cm;[〇〇51 ] 二、寒地冬小麦ISPs的提取[〇〇52]按料液比为lg:15mL将寒地冬小麦面粉与磷酸盐缓冲溶液混合，在室温条件下搅拌提取2.0h，然后用离心机以10000r/min的离心速度离心15min，得到上清液;本实施例采用的是寒地冬小麦粉“东农冬麦1号”，是唯一可以在黑龙江省安全越冬的冬小麦品种，蛋白含量为12.25%;[〇〇53]所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.8,磷酸根浓度为lOOmmol/L;所述搅拌提取时采用磁力搅拌器进行，磁力搅拌器的转速为900r/min;
[0054] 三、冰球提取[0〇55]向步骤二上清液中加入步骤一制备的冰球，放入-18°C的冰箱中，冰提2min，此时冰球吸附冰结构蛋白达到饱和，滤出冰球并置于室温下自然融化得到提取液，滤出冰球后得到剩余的上清液;所述加入上清液的冰球量为每50mL上清液10个；[〇〇56]四、寒地冬小麦ISPs的复提[〇〇57]向剩余的上清液中加入步骤一制备的冰球，重复步骤三4次，收集每次提取得到的提取液，即完成。[〇〇58]本实施例具备以下有益效果:
[0059] 1、本实施例取材于高寒冬小麦，提取的冰结构蛋白为食品源，对于应用于冷冻食品上的安全性有保证；
[0060]2、本实施例寒地冬小麦ISPs冰结构蛋白的提取率为4.56% ;
[0061]3、将寒地冬小麦冰结构蛋白提取液进行浓缩、冷冻干燥得到寒地冬小麦冰结构蛋白冻干粉，将冻干粉复溶，对溶液进行冰晶观察，并与蒸馏水、蔗糖溶液进行对比，结果显示，寒地冬小麦冰结构蛋白溶液冰晶体积小，形态多样，具有较好的冰晶修饰特性；
[0062]4、采取差示扫描量热仪检测本实施例提取的寒地冬小麦冰结构蛋白提取液的热滞活性，提取液浓度为30mg/mL，热滞活性为0.33°C，表明热滞活性显著，由此得出本实施例制备的寒地冬小麦冰结构蛋白具有较强的抗冻活性；
[0063]5、通过冰晶观察，本实施例方法制备的寒地冬小麦ISPs复溶液冰晶分布均匀，形态各异，说明其具有抗冻活性。
【主权项】
1.一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行:一、冰球的制备在硅胶冰格的每个冰孔位置放置玻璃球，向冰孔注蒸馏水，然后置于-18°C的冰箱中冷 冻，得到冰球；二、寒地冬小麦ISPs的提取按料液比为lg: (10?30mL)将寒地冬小麦面粉与磷酸盐缓冲溶液混合搅拌，在室温条 件下搅拌提取0.5?3.0h，然后用离心机离心14?16min，得到上清液；三、冰球提取向步骤二上清液中加入步骤一制备的冰球，放入-18°C的冰箱中，冰提2?4min，此时冰 球吸附冰结构蛋白达到饱和，滤出冰球并置于室温下自然融化得到提取液，滤出冰球后得 到剩余的上清液；四、寒地冬小麦ISPs的复提向剩余的上清液中加入步骤一制备的冰球，重复步骤三2?4次，收集每次提取得到的 提取液，即完成。2.根据权利要求1所述的一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法，其特征在于:步 骤一所述玻璃球的直径为lcm;所述得到的冰球的直径为2cm;所述硅胶冰格为耐温为-40°C 的硅胶冰格，硅胶冰格为板状，长为24cm，宽为7.3cm，板上设置有10 X 2个球形冰孔，每个冰 孔的内径为2cm〇3.根据权利要求1所述的一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法，其特征在于:步 骤二所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.2?8.0，磷酸根浓度为60?140mmol/L。4.根据权利要求1所述的一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法，其特征在于:步 骤二所述搅拌提取时采用磁力搅拌器进行，磁力搅拌器的转速为800?lOOOr/min。5.根据权利要求1所述的一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法，其特征在于:步 骤二所述离心时离心机的转速为8000?10000r/min。6.根据权利要求1所述的一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法，其特征在于:步 骤三所述加入上清液的冰球量为每50mL上清液6?15个。7.根据权利要求1所述的一种从寒地冬小麦中提取冰结构蛋白的方法，其特征在于:步 骤三所述加入上清液的冰球量为每50mL上清液10个。
【文档编号】C07K14/415GK106084023SQ201610726901
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月25日
【发明人】陈凤莲, 曲敏, 鲍欢, 朱姝
【申请人】哈尔滨商业大学