一种支持HeLa细胞贴壁培养的无血清培养基的制作方法

本发明涉及一种支持hela细胞贴壁培养的无血清培养基，属于细胞工程技术领域。

背景技术：

海拉细胞(hela细胞)生长奇快，甚至超越一般癌细胞。海拉细胞经历细胞分裂时可维持端粒酶活性以维持端粒长度，一般细胞的端粒会随着老化而变短，终至细胞死亡。而海拉细胞却拥有端粒修复酶，自动避开海夫力克极限(hayflicklimit)，从而达到“永生”。“海拉”细胞帮助科学家实现了人类科学史上一些最重要的医学突破：化学疗法、克隆、基因组、人工受精等等。到今天，无数科学家还在继续使用“海拉”细胞以期攻克人类未攻克的难题，如癌症、艾滋病、辐射伤害、毒性问题等等，上世纪80年代，德国科学家利用海拉细胞证实了hpv病毒与宫颈癌的因果关系，获1984年诺贝尔奖。21世纪，至少有5项诺贝尔奖与海拉细胞系有关。海拉细胞甚至还被工业用在测试人体对胶带、胶水、化妆品和其他工业品的敏感度上。很多人受益于“海拉”细胞，比如脊髓灰质炎疫苗的研制就与这组细胞关系密切。

细胞培养基是决定细胞体外生长代谢最重要、最直接的环境因素。目前大多数合成细胞培养基均需要补充动物血清才能支持细胞的体外生长、增殖，而动物血清的使用带来了动物性病原微生物污染培养物的可能，因此推动了动物细胞无血清培养基的发展。现有技术中，国外细胞无血清培养基配方保密且价格高，同时市场上已有培养基(国内、国外)成分均不明确。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了一种支持hela细胞贴壁培养的无血清培养基，实现了在不添加血清的情况下培养hela细胞，使其能够维持正常的细胞形态及正常的细胞生长速度。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种支持hela细胞贴壁培养的无血清培养基，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/l：

甘氨酸10～50；

l-丙氨酸2～10；

l-精氨酸盐酸盐50～200；

l-天冬酰胺5～20；

l-天冬氨酸5～20；

l-半胱氨酸盐酸盐10～50；

l-胱氨酸盐酸盐20～50；

l-谷氨酰胺300～500；

l-谷氨酸5～10；

l-组氨酸盐酸盐20～50；

l-异亮氨酸50～100；

l-亮氨酸50～100；

l-赖氨酸盐酸盐50～200；

l-蛋氨酸10～50；

l-苯丙氨酸20～50；

l-脯氨酸10～50；

l-丝氨酸20～50；

l-苏氨酸50～100；

l-色氨酸5～20；

l-酪氨酸50～100；

l-缬氨酸50～100；

生物素0.0001～0.01；

氯化胆碱5～10；

d-泛酸钙1～5；

叶酸1～5；

烟酰胺1～5；

盐酸吡哆醇1～5；

核黄素0.1～1；

硫胺素盐酸盐1～5；

维生素b120.1～1；

肌醇10～20；

无水氯化钙100～200；

五水硫酸铜0.0001～0.01；

九水硝酸铁0.01～0.1；

七水硫酸亚铁0.1～1；

无水氯化镁20～50；

七水硫酸镁20～50；

氯化钾300～500；

碳酸氢钠2000～3000；

氯化钠5000～8000；

磷酸氢二钠50～100；

一水磷酸二氢钠50～100；

七水硫酸锌0.1～1；

葡萄糖2000～3000；

次嘌呤钠1～5；

亚油酸0.1～0.5；

硫辛酸0.1～1；

酚红钠盐5～15；

腐胺盐酸盐0.01～0.1；

丙酮酸钠50～200；

胸腺嘧啶0.1～0.5；

hepes2000～5000；

抗坏血酸100～200；

谷胱甘肽5～20；

胰酶抑制剂50～200；

l多聚赖氨酸0.1～1；

白蛋白1000～3000；

胰岛素5～50；

转铁蛋白5～50；

氯化锰0.0001～0.01；

偏钒酸铵0.0001～0.1；

氯化镍0.0001～0.1；

二水氯化锡0.0001～0.1；

九水硅酸钠0.0001～0.1；

四水钼酸铵0.0001～0.1；

亚硒酸钠0.0001～0.1；

余量为水。

本发明的无血清培养基的制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.1～7.4，滤膜过滤除菌(0.22μm滤膜过滤)，即得，分装。

本发明的支持hela细胞贴壁培养的无血清培养基，根据细胞体外生长的营养需求选择不同营养物质以替代动物血清所发挥的作用，并对不同营养物质的比例进行了合理调整。不需要补充血清就可以支持hela细胞贴壁生长，使其能够维持正常的细胞形态及正常的细胞生长速度。

附图说明

图1：hela细胞呈单层贴壁形式正常生长示意图(低密度)(200×)。

图2：hela细胞呈单层贴壁形式正常生长示意图(高密度)(200×)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1制备无血清培养基

是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/l：

甘氨酸30；

l-丙氨酸6；

l-精氨酸盐酸盐120；

l-天冬酰胺15；

l-天冬氨酸15；

l-半胱氨酸盐酸盐30；

l-胱氨酸盐酸盐40；

l-谷氨酰胺400；

l-谷氨酸8；

l-组氨酸盐酸盐40；

l-异亮氨酸150；

l-亮氨酸70；

l-赖氨酸盐酸盐150；

l-蛋氨酸30；

l-苯丙氨酸30；

l-脯氨酸30；

l-丝氨酸40；

l-苏氨酸70；

l-色氨酸12；

l-酪氨酸80；

l-缬氨酸80；

生物素0.005；

氯化胆碱7；

d-泛酸钙3；

叶酸3；

烟酰胺3；

盐酸吡哆醇3；

核黄素0.5；

硫胺素盐酸盐3；

维生素b120.5；

肌醇15；

无水氯化钙150；

五水硫酸铜0.005；

九水硝酸铁0.05；

七水硫酸亚铁0.5；

无水氯化镁35；

七水硫酸镁35；

氯化钾400；

碳酸氢钠2500；

氯化钠7000；

磷酸氢二钠70；

一水磷酸二氢钠80；

七水硫酸锌0.5；

葡萄糖2500；

次嘌呤钠3；

亚油酸0.3；

硫辛酸0.5；

酚红钠盐10；

腐胺盐酸盐0.05；

丙酮酸钠100；

胸腺嘧啶0.3；

hepes3500；

抗坏血酸150；

谷胱甘肽15；

胰酶抑制剂130；

l多聚赖氨酸0.5；

白蛋白2000；

胰岛素30；

转铁蛋白30；

氯化锰0.005；

偏钒酸铵0.005；

氯化镍0.005；

二水氯化锡0.005；

九水硅酸钠0.005；

四水钼酸铵0.005；

亚硒酸钠0.005；

余量为蒸馏水。

制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入蒸馏水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌，即得，分装，-4℃保存。

实施例2制备无血清培养基

是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/l：

甘氨酸10；

l-丙氨酸10；

l-精氨酸盐酸盐50；

l-天冬酰胺20；

l-天冬氨酸5；

l-半胱氨酸盐酸盐50；

l-胱氨酸盐酸盐20；

l-谷氨酰胺500；

l-谷氨酸5；

l-组氨酸盐酸盐50；

l-异亮氨酸50；

l-亮氨酸100；

l-赖氨酸盐酸盐50；

l-蛋氨酸50；

l-苯丙氨酸20；

l-脯氨酸50；

l-丝氨酸20；

l-苏氨酸100；

l-色氨酸5；

l-酪氨酸100；

l-缬氨酸50；

生物素0.01；

氯化胆碱5；

d-泛酸钙5；

叶酸1；

烟酰胺5；

盐酸吡哆醇1；

核黄素1；

硫胺素盐酸盐1；

维生素b121；

肌醇10；

无水氯化钙200；

五水硫酸铜0.001；

九水硝酸铁0.1；

七水硫酸亚铁0.1；

无水氯化镁50；

七水硫酸镁20；

氯化钾500；

碳酸氢钠2000；

氯化钠8000；

磷酸氢二钠50；

一水磷酸二氢钠100；

七水硫酸锌0.1；

葡萄糖3000；

次嘌呤钠1；

亚油酸0.5；

硫辛酸0.1；

酚红钠盐15；

腐胺盐酸盐0.01；

丙酮酸钠200；

胸腺嘧啶0.1；

hepes5000；

抗坏血酸100；

谷胱甘肽20；

胰酶抑制剂50；

l多聚赖氨酸1；

白蛋白1000；

胰岛素50；

转铁蛋白5；

氯化锰0.01；

偏钒酸铵0.1；

氯化镍0.1；

二水氯化锡0.1；

九水硅酸钠0.001；

四水钼酸铵0.001；

亚硒酸钠0.001；

余量为蒸馏水。

制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入蒸馏水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.4，0.22μm滤膜过滤除菌，即得，分装，-4℃保存。

实施例3制备无血清培养基

是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位为mg/l：

甘氨酸50；

l-丙氨酸2；

l-精氨酸盐酸盐200；

l-天冬酰胺5；

l-天冬氨酸20；

l-半胱氨酸盐酸盐10；

l-胱氨酸盐酸盐50；

l-谷氨酰胺300；

l-谷氨酸10；

l-组氨酸盐酸盐20；

l-异亮氨酸100；

l-亮氨酸50；

l-赖氨酸盐酸盐200；

l-蛋氨酸10；

l-苯丙氨酸50；

l-脯氨酸10；

l-丝氨酸50；

l-苏氨酸50；

l-色氨酸20；

l-酪氨酸50；

l-缬氨酸100；

生物素0.001；

氯化胆碱10；

d-泛酸钙1；

叶酸5；

烟酰胺1；

盐酸吡哆醇5；

核黄素0.1；

硫胺素盐酸盐5；

维生素b120.1；

肌醇20；

无水氯化钙100；

五水硫酸铜0.01；

九水硝酸铁0.01；

七水硫酸亚铁1；

无水氯化镁20；

七水硫酸镁50；

氯化钾300；

碳酸氢钠3000；

氯化钠5000；

磷酸氢二钠100；

一水磷酸二氢钠50；

七水硫酸锌1；

葡萄糖2000；

次嘌呤钠5；

亚油酸0.1；

硫辛酸1；

酚红钠盐5；

腐胺盐酸盐0.1；

丙酮酸钠50；

胸腺嘧啶0.5；

hepes2000；

抗坏血酸200；

谷胱甘肽5；

胰酶抑制剂200；

l多聚赖氨酸0.1；

白蛋白3000；

胰岛素5；

转铁蛋白50；

氯化锰0.001；

偏钒酸铵0.001；

氯化镍0.0001；

二水氯化锡0.001；

九水硅酸钠0.1；

四水钼酸铵0.1；

亚硒酸钠0.1；

余量为蒸馏水。

制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入蒸馏水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.1，0.22μm滤膜过滤除菌，即得，分装，-4℃保存。

实验

将实施例1制备的培养基置于t25细胞培养瓶中，将hela细胞(购自上海细胞保藏中心)以5.0×10⁵cells/ml接种，在温度37℃下培养，培养24小时后，可见hela细胞呈单层贴壁形式正常生长，如图1所示，培养48小时后，如图2所示。

同时，以国外品牌(gibco)的无血清培养基为对照培养hela细胞。

结果：采用本发明的无血清培养基培养hela细胞，无需经过复杂的降血清驯化过程，可直接转换为无血清培养。而国外品牌(gibco)的无血清培养基，则需要10％，5％，2％，1％梯度驯化，驯化周期长，操作复杂。

细胞倍增时间对比：经细胞倍增时间检测如表1所示，本发明的无血清培养基培养的hela细胞，生长迅速，倍增时间最快15个小时，细胞生长迅速，收获细胞多。而国外品牌(gibco)的无血清培养基，倍增时间在20小时左右，速度缓慢。

表1细胞个数

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。