专利名称：一种支持hek293细胞贴附培养的无动物来源成分无血清培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种支持哺乳动物细胞培养的无血清培养基，更具体地说是支持HEK293细胞贴附培养的无动物来源成分无血清培养基，属于细胞工程技术领域。
背景技术：
动物细胞培养是生命科学研究和生物技术应用的关键技术体系。培养基(medium)是决定体外培养细胞生长代谢的最直接、最重要的环境因素。根据培养基使用中是否需要补充动物血清，可将动物细胞培养基大致可划分为合成培养基和无血清培养基(serum freemedium)。
自1950年Morgan等研制的199培养基问世以来，针对不同细胞类型的商品化合成培养基至少已有20余种之多，其中包括EMEM、αMEM、DMEM、IMEM、F12和RPMI 1640等被广泛使用的合成培养基。合成培养基的组成成分一般多达50余种，主要包括碳水化合物、氨基酸、维生素、核酸衍生物、脂类和无机盐等。合成培养基的使用特点是，一般仅能短期维持细胞的生存，需在其中补充5-20％(v/v)的动物血清才能支持体外培养细胞的生长、增殖。由于动物血清的成分十分复杂，其中仅蛋白质的种类就多达500余种。在生命科学研究中，常因动物血清的加入而干扰实验结果、影响细胞的功能和表型。从动物细胞表达产品的生产工艺角度考虑，动物血清批次间的质量差异可造成动物细胞表达产品生产的不稳定性，动物血清中的蛋白组分增加了重组蛋白纯化和质量控制的困难；从动物细胞表达产品的安全性考虑，动物血清的使用带来了动物源性病原微生物污染产品的可能。
1976年Hayashi和Sato首次报道在合成培养基中加入激素后能支持体外培养细胞的生长，由此揭开了动物细胞无血清培养基研究和应用的序幕。20世纪80年代后期以来，随着来人们对体外培养细胞代谢和生理学了解的不断深入、调控细胞生长代谢和分化的细胞因子种类及来源的丰富，商品化的无血清培养基无论在数量上和质量上都有明显的提高，无血清培养基已在生命科学的诸多研究领域和生物技术药物的规模化生产得于广泛应用。
HEK293细胞(human embryonic kidney 293cells)为来源于经5型腺病毒转化的人胚肾上皮样细胞系，是贴附依赖性生长的连续传代细胞。在生命科学研究中，HEK293细胞被广泛用作研究细胞生物学和功能基因组学的细胞模型。近年来，随着生物技术药物产业化的发展和基因治疗研究的不断深入，HEK293细胞作为重组蛋白药物生产的表达系统和重组病毒载体的主要生产细胞的重要性日益显现。
文献报道的HEK293细胞无血清培养基只能支持HEK293细胞的悬浮培养，而且在培养基中加入了牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)等动物来源的添加成分。含BSA的无血清培养基在很大程度上遗留着动物来源血清在动物细胞培养的应用中可能产生的上述问题。美国Invitrogen公司开发的商品化无蛋白培养基(CD293medium)也只适用于HEK293细胞的悬浮培养。迄今为止，国内外均未见有关支持HEK293细胞贴附培养的无动物来源成分无血清培养基的报道。
HEK293细胞的悬浮培养不利于通过培养基的连续灌注操作为细胞的生长和代谢提供充足的营养成分并有效地控制有害细胞代谢产物的积累，从而达到提高细胞培养密度和细胞代谢效率的动物细胞表达产品生产过程优化的目的。另一方面，HEK293细胞的悬浮改变了HEK293细胞贴壁依赖性生长的原本体外培养特性，既影响到HEK293细胞体外培养的细胞表型，也对以HEK293细胞为细胞模型的细胞生物学和功能基因组学研究产生不可避免的干扰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于HEK293细胞体外培养的无血清培养基，该培养基具有不含动物来源成分、能支持HEK293细胞贴附依赖性生长和高密度化培养的特点。
本发明采用的构思在于1).合成培养基的配方均不是针对HEK293细胞而设计的，虽然其能基本满足HEK293细体外胞培养的营养需求，但其中的碳水化合物、氨基酸和无机盐等成份仍存在较大的调整和优化空间；2).合成培养基中缺少能支持动物细胞贴附培养的组成成分，不能直接用于支持动物细胞贴附培养。基于以上考虑，本发明的无血清培养基在F12培养基中加入了以下成分；(1)胰岛素促进细胞对葡萄糖和氨基酸的摄取、促进细胞生长。
(2)氨基酸培养基中氨基酸的浓度通常限制着细胞生长所能达到的最大密度及细胞活力状态，不同细胞对氨基酸的需求可能存在明显的差别，这些氨基酸既包括特定细胞类型不能合成的必需氨基酸，也包括细胞能够合成、但消耗速率大于细胞合成能力的非必需氨基酸。
(3)单糖和双糖果糖可部分地替代葡萄糖作为细胞生长代谢的能量来源之一、减少培养基中因葡萄糖无氧酵解产生的乳酸堆积。海藻糖是由两个葡萄糖分子结合而成的非还原性双糖，对激素、生长因子和酶等生物大分子具有非特异的保护作用，也可作为细胞代谢的能源物质。
(4)微量元素Cu、Fe、Se和Ze等微量元素，主要作为酶的辅基参与细胞代谢的调节。其中Cu超氧化物岐化酶的辅基、具有抗氧化的作用。
Fe细胞色素酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等和血红素的辅基，参与线粒体呼吸链的组成。
Se谷胱甘肽还原酶的组成部分、具有抗氧化的作用。
Ze作为酶的辅基与200多种酶的活性或结构有关，参与细胞生长、蛋白质合成和核酸代谢的调控。
(5)Ca构成细胞间质的重要成分，通过作用于细胞膜表面的钙粘着蛋白和整联蛋白介导细胞的黏附和伸展。
(6)透明质酸细胞外基质成分，提供细胞生长和黏附的环境和基架。
(7)金精三羧酸金属鳌合剂，具有结合、运输和传递Fe2+，部分地替代铁转运蛋白的功能，同时也能通过结合和运输Ca2+促进细胞的黏附和伸展。
(8)乙醇胺磷脂和细胞膜合成的前体物质，对细胞的生长具有一定的促进作用。
(9)酵母水解物为细胞的生长提供氨基酸和维生素等营养成分、促进细胞生长。
(10)羟丙基-β-环状糊精贮存和运送生物大分子，提高生物活性物质的稳定性和生物利用度。
根据以上发明构思，本发明在F12培养基的基础上，将上述物质按以下浓度(mg/L)加入到培养基中，组成了一种新的HEK293细胞无血清培养基(表1)。
表1支持HEK293细胞贴附培养的无动物来源成分无血清培养基
以上无血清培养基组成成分均为商品化的化学/生物化学试剂，其供应商和型号如下F12培养基为美国GIBCO BRL公司的粉状制剂产品，商品号为21700-075。
胰岛素为美国Sigma公司用E.Coli表达的重组产品，商品号为10259。
谷氨酰胺为美国GIBCO BRL公司的粉状制剂产品，商品号为21051-040。
脯氨酸为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为P0380。
精氨酸为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为A4474。
丝氨酸为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为S 4311。
天冬酰胺为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为A4284。
果糖为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为F3510。
海藻糖为南宁中诺生物工程有限公司的医用级粉状制剂产品。
CuSO4·5H20为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为C 8027。
FeSO4·7H2O为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为F 8633。
Na2SeO3为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为S 1382。
ZnSO4·7H2O为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为Z 0251。
CaCl2为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为C 7902。
透明质酸为山东正大福瑞达制药有限公司的医用级粉状制剂产品。
金精三羧酸为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为A 1895。
乙醇胺为美国Sigma公司的液体制剂产品，商品号为E0135。
酵母水解物为美国Sigma公司的粉状制剂产品，商品号为Y0500。
羟丙基-β-环状糊精为杭州正佳化学有限公司的医用级粉状制剂产品。
本发明提供的无血清培养基与现有HEK293细胞无血清培养基相比具有以下优点①能够支持HEK293细胞在组织培养瓶和微载体的表面贴附生长。②不含动物来源成分、化学成分基本明确。③细胞生长良好，细胞的培养密度和活率与含血清合成培养基本相同。④成本低廉。
下面将结合附图和实施例，对本发明作进一步说明。
图1A为倒置显微镜下观察的、在本发明无血清培养基中生长的HEK293细胞；图1B为倒置显微镜下观察到的、在含血清培养基中生长的HEK293细胞。
图2为HEK293细胞分别在本发明无血清培养基中和含血清培养基中培养的细胞密度变化。无血清培养基中培养的HEK293细胞密度(○)；含5％(v/v)小牛血清F12培养基中培养的HEK293细胞密度(▲)。
图3为在5L搅拌罐式生物反应器中用无血清培养基培养HEK293细胞的细胞密度和活力变化。
图4为HEK293细胞在5L搅拌罐式生物反应器中用无血清培养基培养所形成的细胞团。
具体实施例方式
实施例1、在100ml组织培养瓶中贴附培养HEK293细胞将表2所列培养基成分定溶于1000ml去离子水中，室温下搅拌30min，使其充分溶解。用0.2μm滤膜过滤除菌后，置4℃冰箱保存。
表2在100ml组织培养瓶中培养HEK293细胞的无血清培养基
将在100ml组织培养瓶中用无血清培养基培养的HEK293细胞(购自美国Invitrogen公司)用0.25％(w/v)的胰蛋白酶室温下消化2min。用无血清培养基清分散并调整细胞悬液浓度为2×105cells/ml，按10ml/瓶接种100ml组织培养瓶，每次接种7个培养瓶，37℃、5％CO2静止培养，用倒置显微镜观察细胞形态并拍照纪录。每天取其中的1瓶细胞经0.25％(w/v)胰蛋白酶消化处理后，用细胞密度和活力自动分析系统(Cedex A20，Innovais)计数细胞密度。剩余细胞于培养的第2天起，根据培养基的颜色变化，每天按50～100％培养体积更换新鲜培养基。培养4天后，HEK293细胞形成致密单层，细胞形态呈现多角形上皮样细胞特征(图1A)。
将在100ml组织培养瓶中用含5％(v/v)小牛血清的F12培养基培养的HEK293细胞用0.25％(w/v)的胰蛋白酶室温下消化5min。用含5％(v/v)小牛血清的F12培养基无血清培养基分散并调整细胞悬液浓度为2×105cells/ml，按10ml/瓶接种100ml组织培养瓶，每次接种7个培养瓶，于37℃、5％CO2静止培养。除用含5％(v/v)小牛血清的F12培养基替代上述的无血清培养基外，HEK293细胞的培养和计数方法均与上述方法相同，以此作为实施例的对照。培养4天后，含5％(v/v)小牛血清F12培养基中的HEK293细胞形态与无血清培养基中培养的HEK293细胞相同(图1B)。HEK293细胞在无血清培养基中的生长动力学和细胞密度与其在作为实施例对照的含5％(v/v)小牛血清F12培养基中的培养效果相当(图2)。
实施例2、在5L搅拌罐式生物反应器中连续灌注培养HEK293细胞将在2000ml转瓶中用表2所列的无血清培养基培养的HEK293细胞用0.25％(w/v)的胰蛋白酶室温下消化2min。用表3列的无血清培养基分散细胞并接种于工作体积为5L、装备有内置式旋转滤器的搅拌罐式生物反应器内(德国B.Braun Biotecn International公司)，接种密度为4.5×105cells/ml。温度设置为37℃、溶解氧浓度控制在30～50％、pH控制在7.1～7.2。搅拌速度在培养的第1～3天设置为35～50r/min，使HEK293细胞相互聚集、形成细胞团，从第4天起，根据HEK293细胞团的平均粒径变化，在50～120r/min的范围内逐步提高搅拌速度。
表3在5L生物反应器中灌注培养HEK293细胞的无血清培养基
每天取样用YSI 7100型多参数生物分析系统(YSI 7100，Yellow Springs Instrumems)检测培养基中的葡萄糖和乳酸浓度，用CedexA20测定细胞密度和细胞活力。培养1天后，启动生物反应器的培养基灌注系统，利用生物反应器中微孔径为75μm的内置式旋转过滤器截流细胞团，根据细胞密度和葡萄糖浓度将灌注速率调整为0.15～1.5volume/day，实施HEK293细胞的无血清连续灌注培养操作。
整个培养过程持续17天，HEK293细胞的密度由接种时的4.5×105cells/ml增加到的培养结束时的13.7×106ceHs/ml，HEK293细胞的活力在整个培养过程中保持在大于90％的水平(图3)。HEK293细胞的形状在流体动力作用下形成形状相对规整、大小相对均一的球状细胞团(图4)。
本发明的特定实施例已经对本发明的内容做了详尽的说明。对本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干步骤的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。
权利要求
1.一种支持HEK293细胞贴附培养的无动物来源成分无血清培养基，其特征在于由下列物质按以下浓度(mg/L)加入到F12培养基中组成胰岛素 2.5～10谷氨酰胺 250～500脯氨酸 50～100精氨酸 200～400丝氨酸 40～60天冬酰胺 40～60果糖 1000～2000海藻糖 100～500CuSO4·5H2O 0.05～0.5FeSO4·7H2O 0.2～2Na2SeO30.005～0.02ZnSO4·7H2O 0.2～2CaCl2100～200透明质酸 25～50金精三羧酸 2.5～5乙醇胺 2.5～5酵母水解物 500～1000羟丙基-β-环状糊精 250～500。
2.根据权利要求1所述的一种支持HEK293细胞贴附培养的无动物来源成分无血清培养基，其特征在于由下列物质按以下浓度(mg/L)加入到F12培养基中组成胰岛素 2.5～10谷氨酰胺 250～500脯氨酸 50～100精氨酸 200～400丝氨酸 50天冬酰胺 50果糖 1000～2000海藻糖100～500CuSO4·5H2O 0.05～0.5FeSO4·7H2O 0.2～2Na2SeO30.005～0.02ZnSO4·7H2O 0.2～2CaCl2150透明质酸 25～50金精三羧酸2.5～5乙醇胺2.5～5酵母水解物500～1000羟丙基-β-环状糊精250～500。
全文摘要
本发明公开了一种支持HEK293细胞贴附培养的无动物来源成分无血清培养基。该无血清培养基由F12培养基和胰岛素、氨基酸、单糖及双糖、微量元素、CaCl
文档编号C12N5/06GK1772884SQ200510109050
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月18日 优先权日2005年10月18日
发明者陈昭烈, 刘红, 熊福银, 刘兴茂, 叶玲玲, 李世崇, 吴本传, 王启伟 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所