一种动物细胞贴壁培养装置制造方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种动物细胞贴壁培养装置，包括锥形培养瓶，所述的培养瓶的瓶口处设置有可拆卸的瓶口内套，在锥形瓶中设置有提斗挂杆，提斗挂杆的上端可拆卸地安装在瓶口内套上，提斗挂杆的下端设置有空载提斗；在瓶口内套上设置有用于密封瓶口内套的上盖。本装置经过清洁处理后高压灭菌可反复使用，成本低廉；在工程细胞抗体制备及表达过程中，可配套CO2培养箱或细胞培养摇床进行1L-10L规模的细胞培养放大抗体制备，方法简单便于操作；针对不同细胞种系在采用本装置选用载体的同时，也可根据自身细胞特性，选择其他商品化载体，大大扩展了本装置的应用范围，能够为细胞生物学实验提供有力的支持。
【专利说明】一种动物细胞贴壁培养装置
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及细胞工程【技术领域】，主要涉及一种动物细胞贴壁培养装置，用于 各类贴壁生长的工程细胞，如CH0细胞、HEK293细胞及杂交瘤细胞等。
【背景技术】
[0002] 动物细胞培养的基础是组织细胞培养技术。近来由于生物科学和技术科学相互渗 透、遗传学和生物化学的相互结合，分子遗传学、分子生物学和细胞工程等新型学科迅速发 展。这些新学科的形成与发展都与组织培养技术密切相关，目前的组织细胞培养技术不仅 是用于研究生命科学理论的重要技术方法，同时也日益成为生物工程、基因工程制药的生 产工具和手段。
[0003] 贴壁培养（anchorage-dependent culture)是让细胞贴附在某种基质上进行增殖 的培养方法，主要适用于一切贴壁细胞，也适用于兼性贴壁细胞。实际生产中具有贴壁生长 特性的细胞种类较多，如CH0细胞、BHK细胞和Vero细胞等。
[0004] 贴壁培养的主要优点是细胞可贴附于培养介质内外表面，细胞将有效的表达产 品，同时容易进行培养液的更换，容易采用灌流培养的模式，培养过程不段添加新鲜培养 液，去除代谢产物，从而使单位体积内细胞密度较高，与悬浮培养相比可维持的培养周期相 对较长。而贴壁培养的不足之处是操作比较繁琐，需要合适的贴附材料以及足够的贴附面 积，培养条件不均一。由于贴壁细胞的贴壁要求，提高细胞密度的有效方法就是使反应体系 中比表面积最大化。传统的贴壁细胞培养方法包括转瓶（roller bottle)、多层平板培养 如Nune公司、CellCube和Costar公司的细胞工厂（cell factories)，和搅拌式微栽体悬 浮培养。
[0005] 现有的贴壁细胞培养技术，存在相当多的弊端，如劳动、设备、耗材的消耗大大增 加了生产成本，如Costar公司的5L体积细胞工厂系统和GE公司的50mg规格disc碟形载 体等价值万元的一次性耗材设备；大体积的转瓶、细胞工厂因为清洁原因难以重复使用，为 增加其贴壁面积，体积或数量也相应增加，使得操作、污染防范变得更加困难；由于细胞贴 壁生长，在培养结束后，贴壁介质表面会附着大量的粘连蛋白和细胞碎片，使得系统的清洁 和质量控制变得更加困难，外源污染的控制又增加了额外的研发成本。所以这些因素大大 限制了贴壁细胞培养在抗体研发过程中的应用。
【发明内容】
[0006] 本实用新型的目的在于，提供一种用于动物细胞贴壁培养的装置，可针对CH0细 胞、HEK293细胞及杂交瘤细胞等贴壁生长的动物细胞，进行中试规模的细胞培养，进行百毫 克级的目标蛋白抗体的表达，提高前期抗体药物开发效率，降低研发成本，同时为肿瘤或组 织细胞体外大量扩增及DNA载体体外转染等相关实验研究提供有力的支持。
[0007] 本实用新型采用以下技术方案：
[0008] -种动物细胞贴壁培养装置，包括锥形培养瓶，所述的培养瓶的瓶口处设置有可 拆卸的瓶口内套，在锥形瓶中设置有提斗挂杆，提斗挂杆的上端可拆卸地安装在瓶口内套 上，提斗挂杆的下端设置有空载提斗；在瓶口内套上设置有用于密封瓶口内套的上盖。
[0009] 进一步地，所述的提斗挂杆包括弯杆，弯杆由相互平行的上段杆和下段杆以及连 接上段杆和下段杆的连接杆组成，为一体式结构；上段杆的长度大于下段杆的长度，上段 杆的顶端固结有宽度大于上段杆直径的卡片，在下段杆上加工有用于安装空载提斗的外螺 纹。
[0010] 进一步地，提斗挂杆安装在瓶口内套上时，提斗挂杆和空载提斗的下端均不与培 养瓶底面接触。
[0011] 进一步地，所述的空载提斗为空心的矩形体结构，在空载提斗的侧壁上均匀分布 有多个穿透侧壁的圆孔，空载提斗通过其上部的上紧固螺母和下部的下紧固螺母安装在提 斗挂杆的下段杆上。
[0012] 进一步地，所述的瓶口内套包括环形套和与环形套同轴心线固结的套筒，环形套 的内径与套筒的内径相同，套筒的外径小于培养瓶瓶口的内径，环形套的外径大于培养瓶 瓶口的外径。
[0013] 进一步地，在环形套和套筒的内壁上沿轴向加工有用于安装提斗挂杆的卡槽，卡 槽长度小于瓶口内套的轴向长度。
[0014] 进一步地，所述的空载提斗中装有载体，空载提斗位于培养瓶的中下部位置。
[0015] 进一步地，所述的空载提斗在培养瓶中设置1?4个。
[0016] 本实用新型的技术优点：
[0017] 1)本装置可应用于动物细胞贴壁培养，在细胞生物学及细胞工程领域，有广泛的 应用价值，适用于细胞增殖培养或工程细胞培养抗体制备等相关实验研究；
[0018] 2)本装置可对振荡器旋转速率、提斗挂杆类型、贴壁载体类别进行选、择调整，以 优化培养系统的细胞贴附能力，增加细胞培养周期，提高细胞密度及产物产量；
[0019] 3)本装置操作简便、成本低廉，提斗及培养瓶可经过碱液处理清洁后高压后重复 使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1是本装置的整体结构示意图；
[0021] 图2是提斗挂杆部分的正视图；
[0022] 图3是提斗挂杆部分的侧视图；
[0023] 图4是瓶口内套的轴向剖视图；
[0024] 图5是瓶口内套的俯视图；
[0025] 图6是三种细胞方瓶及本装置贴壁培养密度对比；
[0026] 图7是三种细胞硼酸盐玻璃纤维贴壁培养显微观察；
[0027] 图8是293T细胞锥形瓶内贴壁转染eGFP-Nl质粒绿色荧光蛋白表达；
[0028] 图9是对比实例3的H18嵌合抗体表达制备对比图；
[0029] 图10是对比实例4的CypA抗体表达制备对比图；
[0030] 图11是对比实例5的H18嵌合抗体表达制备对比图；
[0031] 图中标号代表：1 一上盖，2-套筒，3-培养瓶，4一上段杆，5-连接杆，6-上紧固 螺母，7-盖体，8-空载提斗，9-下段杆，10-下紧固螺母，11-环形套，12-卡槽，13-卡 片；
[0032] 以下结合附图和发明人给出的【具体实施方式】对本发明进一步详细说明。
【具体实施方式】
[0033] 遵从上述技术方案，如图1至图3所示，一种动物细胞贴壁培养装置，包括锥形培 养瓶3,所述的培养瓶3的瓶口处设置有可拆卸的瓶口内套，在锥形瓶中设置有提斗挂杆， 提斗挂杆的上端可拆卸地安装在瓶口内套上，提斗挂杆的下端设置有空载提斗8 ;在瓶口 内套上设置有用于密封瓶口内套的上盖1。
[0034] 本装置的主体结构为透明的锥形培养瓶3,培养瓶3的瓶口上设置有瓶口内套。如 图4所示，瓶口内套包括环形套11和与环形套11同轴心线固结的套筒2,环形套11的内径 与套筒2的内径相同，套筒2的外径小于培养瓶3瓶口的内径，环形套11的外径大于培养 瓶3瓶口的外径，使用时将瓶口内套塞在培养瓶3的瓶口上，用来安装提斗挂杆。为了保证 培养瓶3的密封性，套筒2的外径宜略小于瓶口的内径。
[0035] 瓶口内套上设置有上盖1，上盖1的纵向截面为倒梯形，当瓶口内套装在培养瓶3 的瓶口上时，将上盖1用以密封瓶口内套。
[0036] 提斗挂杆包括弯杆，弯杆由相互平行的上段杆4和下段杆9以及连接上段杆4和 下段杆9的连接杆5组成，为一体式结构；上段杆4的长度大于下段杆9的长度，上段杆4 的顶端固结有宽度大于上段杆4直径的卡片13,卡片13的作用是卡在瓶口内套中的卡槽 12中；在下段杆9上加工有用于安装空载提斗8的外螺纹。提斗挂杆安装在瓶口内套上时， 提斗挂杆和空载提斗8的下端均不与培养瓶3底面接触，保持一定的距离。
[0037] 空载提斗8为空心的矩形体结构，其上部有盖体7,在空载提斗8的侧壁上均匀分 布有多个穿透侧壁的圆孔，空载提斗8的上端和下端分别设置有上紧固螺母6和下紧固螺 母10,通过两个螺母将其紧固安装在提斗挂杆的下段杆9上，并可以进行拆卸。
[0038] 在瓶口内套的内壁上，即环形套11和套筒2的内壁上，沿其轴向加工有用于安装 提斗挂杆的卡槽12,如图5所示；卡槽12长度小于瓶口内套的轴向长度，即卡槽12相对 于瓶口内套的轴向是未通透的，将提斗挂杆的卡片13沿卡槽12的延伸方向放置在卡槽12 中，即可用于挂载空载提斗8 ;而将提斗挂杆从卡槽12中提出，即可实现提斗挂杆与瓶口内 套的分离。空载提斗8优选在培养瓶3中设置1?4个。
[0039] 瓶口内套、提斗挂杆、空载提斗8及上紧固螺母6、下紧固螺母10均采用316L不锈 钢制作，瓶口内套、提斗挂杆与空载提斗8内外表面均经过抛光处理。
[0040] 本装置采用悬挂设计将不锈钢空载提斗8悬挂于培养瓶3的中下部，可通过过变 更挂杆类型调节空载提斗8距离锥形瓶中心的距离，从而调整液流湍动程度。
[0041] 在空载提斗8中的载体在高压灭菌前进行清洁与填充，载体为硼酸盐玻璃纤维 丝，使用多聚赖氨酸进行表面处理，增加细胞贴附力度，同时本装置可选择填装巨载体、碟 形载体等直径大于2mm的商品化载体。
[0042] 本装置的清洁及安装
[0043] 1)使用5 % DeC〇n90清洗液浸泡培养瓶3、载体及各个部件过夜；
[0044] 2)分别使用自来水及纯水充分冲洗瓶体、载体及各个部件；
[0045] 3)以当日纯水pH为标准，使用pH试纸检测各部件残水pH值，直至与纯水pH相 等；
[0046] 4)称取适量载体（硼酸盐玻璃纤维或商品化载体），打开空载提斗8的盖体7,将 载体装入空载提斗8中；将空载提斗8的盖体7由下端穿入提斗挂杆中，连接提斗挂杆与下 紧固螺母10,封闭空载提斗8,旋紧提斗挂杆上方的上紧固螺母6 ;
[0047] 5)将安装完成的空载提斗8依次缓慢垂直放入锥形培养瓶3中；
[0048] 6)将瓶口内套套装入锥形培养瓶3中，将提斗挂杆上端卡口装卡
[0049] 入瓶口内套的卡槽12内，盖上锥形培养瓶3上盖1 ;
[0050] 7)放入高压灭菌器中，将锥形培养瓶3上盖1旋开1/3,开始高压灭菌，121 °C高压 30min ；
[0051] 8)高压灭菌完成后，封闭锥形培养瓶3的上盖1，待用。
[0052] 硼酸盐玻璃纤维载体处理
[0053] 通过多聚赖氨酸处理可提高硼酸盐玻璃纤维的细胞贴附能力，实验发现除杂交瘤 细胞及Vero细胞外，肿瘤细胞、CH0细胞、HEK293细胞及BHK21细胞对硼酸盐玻璃纤维有良 好的贴附能力。所以，可根据具体培养情况选择是否进行多聚赖氨酸处理。
[0054] 1)使用PBS配制100 μ g/ml多聚赖氨酸溶液,0. 22 μ m滤器过滤除菌；
[0055] 2)无菌PBS稀释至25 μ g/ml，加入本装置的无菌锥形培养瓶3中，液体应浸没空 载提斗8的上部；
[0056] 3)室温过夜，PBS冲洗3遍后，待用；
[0057] 细胞培养生长实例1
[0058] 1.细胞接种
[0059] 将约IX 107cells数量的CH〇-kl、HEK293T、H18杂交瘤细胞接种至分别加装玻璃 纤维及GE公司商品化disc碟形载体的锥形培养瓶3中，补加1640添加10%胎牛血清培养 基至500ml，放置于细胞摇床中；
[0060] 1)培养观察
[0061] 每日显微镜观察上清液中细胞悬浮状况；
[0062] 2)细胞计数
[0063] 培养5天后，弃去上清液，50ml胰酶消化各提斗中细胞，血细胞计数器进行细胞计 数；
[0064] 3)实验结果
[0065] 接种24h后，细胞均贴附于载体中，上清取样观察基本无细胞悬浮，48_72h间可观 察到上清液逐渐变黄，72h后上清液中脱落细胞及碎片逐渐增加；回收消化计数结果见图 6,结果显示应用本装置可实现细胞贴壁培养大量扩增，商品化载体disc贴壁载体培养效 果略优于硼酸盐玻璃纤维载体，玻璃纤维载体显微图片见图7。
[0066] 质粒DNA转染实例2
[0067] 1)细胞接种
[0068] 将约IX 107cells数量HEK293T接种至加装硼酸盐玻璃纤维锥形培养瓶3中，补 加1640添加10%胎牛血清培养基至450ml，放置于细胞摇床中过夜培养；
[0069] 2)质粒转染
[0070] i.按照PEI (sigma)使用说明书，以PEI/DNA1:2比例混匀eGFP-Nl质粒DNA与PEI 溶液，质粒DNA实验浓度2ug/ml，室温放置lOmin ;
[0071] ii.弃去培养瓶3内血清培养基，使用无菌PBS溶液轻轻冲洗1-2次，加入 450ml 1640 培养基；
[0072] iii.将质粒DNA与PEI共聚物溶液加入培养瓶3中，放入细胞摇床中培养4h后， 加入10 %胎牛血清，继续培养；
[0073] 3)荧光蛋白表达观察
[0074] 24h后，取出玻璃纤维载体，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达状况；
[0075] 4)实验结果
[0076] 如图8显示，24h后293T细胞贴壁状态良好，转染eGFP-Nl质粒后，绿色荧光蛋白 正常表达，且具有较高的荧光强度。
[0077] H18抗体表达制备对比实例3
[0078] 1)细胞接种
[0079] i.将约lX107cells数量的H18杂交瘤细胞接种至培养瓶3中，瓶中分别加载GE 公司disc载体及玻璃纤维载体，分别补加1640添加10%胎牛血清培养基至500ml ;
[0080] ii.将培养瓶3放置于C02培养摇床中，旋转振荡，设置转速50rpm/min，观察培 养；
[0081] ^丨.4811后细胞工厂补加11^1640添加10%胎牛血清培养基，培养瓶3逐步调节振 荡器转速至80rpm/min ;
[0082] iv. 5天后回收上清液，AKTA亲和层析系统纯化目标抗体
[0083] 2)制备检测
[0084] 经过5天培养，细胞工厂回收上清约1.9L，获得抗体85.8mg，得率为45. 16mg/ L ;本装置回收上清0. 85L，获得抗体38. 6mg，得率为45. 4mg/L，产量无明显差别；经过 SDS-PAGE检测，抗体纯度及分子量无明显差异，如图9所示。
[0085] CypA抗体表达制备对比实例4
[0086] 1)细胞接种
[0087] i.将约lX107cells数量的H18杂交瘤细胞接种至培养瓶3中，瓶中分别加载GE 公司disc载体及玻璃纤维载体，分别补加1640添加10%胎牛血清培养基至500ml ;
[0088] ii.将培养瓶3放置于C02培养摇床中，旋转振荡，设置转速60rpm/min，观察培 养；
[0089] iii. 48h后培养瓶3逐步调节振荡器转速至100rpm/min ;
[0090] iv. 5天后回收上清液，AKTA亲和层析系统纯化目标抗体。
[0091] 2)制备检测
[0092] 经过5天培养，Ge公司disc载体回收上清0. 45L，获得抗体5. 15mg，得率为 11. 4mg/L ;玻璃纤维载体回收上清0. 45L，获得抗体4. 28mg，得率为9. 5mg/L，产量无明显差 另IJ ;经过SDS-PAGE检测，抗体纯度及分子量无明显差异，如图10所示。
[0093] H18嵌合抗体表达制备对比实例5
[0094] 1)细胞接种
[0095] i.将约lX107cells数量的H18杂交瘤细胞接种至培养瓶3中，瓶中分别加载GE 公司disc载体及玻璃纤维载体，分别补加1640添加10%胎牛血清培养基至500ml ;
[0096] ii.将培养瓶3放置于C02培养摇床中，旋转振荡，设置转速60rpm/min，观察培 养；
[0097] iii. 48h后培养瓶3逐步调节振荡器转速至100rpm/min ;
[0098] iv. 5天后回收上清液，AKTA亲和层析系统纯化目标抗体
[0099] 2)制备检测
[0100] 经过5天培养，Ge公司disc载体回收上清0. 45L，获得抗体37. 26mg，得率为 82. 8mg/L ;玻璃纤维载体回收上清0. 45L，获得抗体39. 42mg，得率为87. 6mg/L，产量无明显 差别；经过SDS-PAGE检测，抗体纯度及分子量无明显差异，如图11所示。
【权利要求】
1. 一种动物细胞贴壁培养装置，包括锥形培养瓶（3)，其特征在于，所述的培养瓶（3) 的瓶口处设置有可拆卸的瓶口内套，在锥形瓶中设置有提斗挂杆，提斗挂杆的上端可拆卸 地安装在瓶口内套上，提斗挂杆的下端设置有空载提斗（8);在瓶口内套上设置有用于密 封瓶口内套的上盖（1)。
2. 如权利要求1所述的动物细胞贴壁培养装置，其特征在于，所述的提斗挂杆包括弯 杆，弯杆由相互平行的上段杆（4)和下段杆（9)以及连接上段杆（4)和下段杆（9)的连接杆 (5)组成，为一体式结构；上段杆（4)的长度大于下段杆（9)的长度，上段杆（4)的顶端固 结有宽度大于上段杆（4)直径的卡片（13)，在下段杆（9)上加工有用于安装空载提斗（8) 的外螺纹。
3. 如权利要求1所述的动物细胞贴壁培养装置，其特征在于，提斗挂杆安装在瓶口内 套上时，提斗挂杆和空载提斗（8)的下端均不与培养瓶（3)底面接触。
4. 如权利要求2所述的动物细胞贴壁培养装置，其特征在于，所述的空载提斗（8)为空 心的矩形体结构，在空载提斗（8)的侧壁上均匀分布有多个穿透侧壁的圆孔，空载提斗（8) 通过其上部的上紧固螺母（6)和下部的下紧固螺母（10)安装在提斗挂杆的下段杆（9)上。
5. 如权利要求1所述的动物细胞贴壁培养装置，其特征在于，所述的瓶口内套包括环 形套（11)和与环形套（11)同轴心线固结的套筒（2)，环形套（11)的内径与套筒（2)的内 径相同，套筒（2)的外径小于培养瓶（3)瓶口的内径，环形套（11)的外径大于培养瓶（3) 瓶口的外径。
6. 如权利要求5所述的动物细胞贴壁培养装置，其特征在于，在环形套（11)和套筒 (2)的内壁上沿轴向加工有用于安装提斗挂杆的卡槽（12)，卡槽（12)长度小于瓶口内套的 轴向长度。
7. 如权利要求1所述的动物细胞贴壁培养装置，其特征在于，所述的空载提斗（8)中装 有载体，空载提斗（8)位于培养瓶（3)的中下部位置。
8. 如权利要求1所述的动物细胞贴壁培养装置，其特征在于，所述的空载提斗（8)在培 养瓶⑶中设置1?4个。
【文档编号】C12M3/04GK203999636SQ201420408859
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】陈志南, 张阳, 王彬, 张征, 南刚, 孙秀璇, 冯飞, 王晔, 徐力清, 姚西英 申请人:中国人民解放军第四军医大学