专利名称：动物细胞流加培养方法
技术领域：
本发明涉及一种动物细胞的大规模、高密度流加培养的方法。
背景技术：
动物细胞大规模培养已经被广泛应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗体、病毒疫苗、免疫调节因子、生长因子、特定肿瘤抗原以及各种基因重组蛋白质药物。动物细胞同微生物相比具有转录后修饰的能力，能够高效地表达和生产各类高质量的蛋白质。然而，用于动物细胞培养的培养基价格昂贵，表达量低造成分离纯化的成本较高。因此，提高细胞密度和产物浓度，降低培养基消耗在工业应用上具有重要意义。
简单的批培养(Batch)中，随着营养物的消耗和副产物积累，细胞停止生长并开始死亡，产物也停止表达，生产效率很低。为了克服批培养的这些弊端，开发出了流加培养(Fed-batch)，即在培养过程中，根据细胞代谢需求，连续或间歇地向反应器内加入某一种或几种特定的限制性底物。流加培养同批培养相比，培养周期延长，能够最终获得更高的活细胞密度和产物浓度(J.B.Griffith，Animal Cell Culture and Production ofBiologicals，pp.401-410，Klumer Academic Publishers，R.Sasaki and K.Ikura(eds)，(1991)，Robbinson D K，Seamans T C，et al.Optimization of a fed-batch process for production ofa recombinant antibody.Annals NY Academy Sciences，(1994)，745185-296.)代表性的范例如，Xie等(Xie LZ and Wang D I C.High cell density and high monoclonal antibodyproduction through medium design and rational control in a bioreactor.Biotechnol.Bioeng，(1996)，51725-729.)根据细胞组成(蛋白质、RNA、DNA、脂、碳水化合物)和产物组成、维生素和ATP需求来设计营养物浓度和流加速率，当葡萄糖和谷氨酰胺在低浓度时，根据细胞密度和生长速率决定流加速率。用这种方法细胞密度和单抗浓度分别提高了2倍和10倍，方瓶中单抗浓度达到0.5g/L，反应器中达到0.9g/L。
Zhou等(Zhou WC，Rehm J & Hu WS.High viable cell concentration fed-batch culturesof Hybridoma through on-line nutrient feeding.Biotechnol Bioeng，(1995)，46579-587.)通过在线检测OUR，并通过细胞耗氧和营养消耗之间的化学计量关系，动态流加无盐的完全浓缩培养基进行杂交瘤细胞流加培养，活细胞密度达到了1.2×107cells/mL，细胞代谢从乳酸和氨的高生成、氧的低消耗转化为乳酸和氨的低生成、氧的高消耗。
但是，要达到优化的流加过程，关键是实现过程中细胞的优化控制，即研究细胞的代谢规律并确定优化的控制目标。显然，Xie等的方法虽然看似精确，但过于复杂必然导致研究周期长和工作量巨大。同时，在动物细胞流加培养过程中，细胞的代谢规律和生理状态并不是恒定不变的，因此无论是Xie还是Zhou的方法设计上都没有具体考虑过程的反馈和校正，一旦差别存在就将引起过程的不稳定，甚至发散，导致最终的失败。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于公开一种动物细胞流加培养方法，以满足有关领域发展的需要。
本发明的方法包括如下步骤(a).用于代谢规律研究的流加培养过程。获得细胞在不同生理状态下的代谢规律，建立细胞的代谢动力学模型；确定流加培养的优化控制目标；根据细胞的代谢动力学确定优化的流加培养基成分比例。
(b).用于高密度培养的优化流加培养过程。根据设备的操作参数和(a)中获得的优化流加培养基成分比例，确定优化的培养基组成；根据细胞的指数生长规律进行指数的流加培养，调控细胞生理状态处于优化的控制目标；同时，根据取样获得的细胞密度和培养环境中氨的浓度，反馈修正流加速率，避免系统的发散。
实施上的路线，(a).研究细胞的代谢规律和确定优化目标要研究细胞处于不同生理状态下的代谢规律，传统上是采用批培养分析或者所谓的脉冲试验方法。批培养过程中取样间营养物浓度变化很大，呈现出严重的时变性和不确定性，无法控制培养环境和状态，尤其给研究在低营养物浓度下细胞的生长代谢规律带来很大的困难。脉冲试验方法看似合理，但是细胞对培养环境的变化有一个适应的过程，突然处于一种新的环境下并不能马上呈现出真实的代谢规律。
本发明的方法上可以解决这个问题，通过合理的设计流加培养基和流加速率，可以实现细胞在不同培养条件下的长期拟稳态生长。同时，由于流加培养周期比连续恒化培养或灌注培养要短很多，就为快速地获得细胞在不同生理状态下的代谢规律并确定优化控制目标，提供了方便。
由于培养基组成很复杂，并且各种成份间往往存在替代、互补等交互作用，总体优化设计是非常复杂的。简化处理方法是，考察几种极端的培养状态下的代谢规律，缩小寻优范围和逐步确定优化目标。由于乳酸和氨是限制细胞密度和产物浓度提高的主要副产物，一般的策略是限制培养环境中的葡萄糖或(和)谷氨酰胺浓度，因此，重点考察细胞在葡萄糖限制和谷氨酰胺限制状态下的代谢规律。为实现相应状态下的拟稳态生长，根据批培养的实验数据设计起流加培养基和流加速率，根据基本的动力学参数进行合理地假设和估计，设计相应的流加过程。
以葡萄糖限制的流加培养设计为例根据批培养的实验结果，当Glucose＜0.5mmol/L，Glutamine＞0.3mmol/L，并且其它营养物不构成限制时，可认为处于葡萄糖限制培养状态。同时，为尽可能排除副产物对生长的影响，上述培养状态下需Lactate＜40mmol/L，Ammonia＜6mmol/L。由以往的实验结果初步获得这种状态下qgluc1.3mmol/(109cells·day)，qgln0.65mmol/(109cells·day)，qNH30.5mmol/(109cells·day)，YNH3/gln0.75。实验采用2L的生物反应器，初始培养体积700ml，流加速率选择为200ml/day，由此可估计流加过程中稀释率D0.3～0.1 1/day。起始培养基为Hybri SFM I(本实验室自己开发)，细胞密度大于1.0×106mmol/L时开始流加，此时氨的浓度约为2.0mmol/L，流加后较长一段时间内细胞的平均比生成速率在0.5 1/day左右。
最大活细胞密度(此时，认为主要是副产物氨抑制引起细胞生长的停止)的估计， 设计当X3.0×106cells/L时达到葡萄糖限制，此时D0.25 1/day。
流加培养基中葡萄糖浓度的估计，Gluc=qsXD=1.3×30.25=15.6mmol/L,]]>取Gluc＝16mmol/L。
流加培养基中谷氨酰胺浓度的估计，Gln≥S+qsXD=0.3+0.65×30.25=8.1mmol/L]]>(避免底物谷氨酰胺限制)Glnin≤S+qsXvmaxD=S+qpYP/S·XvmaxD≈S+PYP/S=0.3+60.75=8.3mmol/L]]>(氨抑制，dPdt≈0]]>)_庢Gln＝8.3mmol/L丅其它营养物如氨基酸浓度根据它们同葡萄糖或谷氨酰胺比消耗速率的比例关系确定。
比较细胞在不同状态下的代谢规律，确定优化的培养目标。同时，获得细胞的代谢动力学关系[1].---qs=1VXv[FSin-d(VS)dt],qp=1VXvd(VP)dt]]>[2].CGln＝f(qNH3)根据[1]，确定培养基各种营养成分的比例。
(b).优化的流加培养过程处于特定生理状态下的细胞是呈指数地扩增生长的，因此以调控细胞处于优化的目标生理状态下的流加过程也是指数流加的过程。但是在培养过程中，细胞的实际生理状态仍会不断发生变化，因此，在实际操作上，最好能够进一步地反馈修正流加过程。
指数流加在实施上只能用无数的分阶段恒速流加来代替，每一时间段内的流加速率由该阶段中理论指数流加速率对时间的平均值确定。在ti到ti+1之间，拟稳态处理(假设细胞处于特定的生理状态，即μ，qs不变)，并假设μiμi-1，qsi≈qsi-1,]]>流加速率由下式确定[3].---Fi=F(ti→i+1)‾=∫titi+1F(t)dt/(ti+1-ti)=biXiVi[exp[μi(ti+1-ti)]-1]ti+1-ti]]>其中μi=dlnXiVidt≈μi-1≈ln(XiVi/Xi-1Vi-1)ti-ti-1]]>bi=1Yx/si·Sin=qsiSinμi≈qsi-1Sinμi-1]]>qsi-1=1(VX‾)iFi-1(Sin-Si-1)≈Fi-1Sin·[lnViXiVi-1Xi-1/(ViXi-Vi-1Xi-1)]]]>若等时间间隔(ti-ti-1＝ti+1-ti)取样，由以上关系得流加控制的迭代关系(Feed-forward algorithm)为 .---Fi=XiViXi-1Vi-1·Fi-1]]>其中，Vi＝Vi-1+Fi-1·(ti-ti-1)-(v庢样)i考虑到流加过程中细胞实际的生理状态不断发生变化，试验阶段，尽量缩小取样间隔和检测氨的浓度，根据[2]中获得的代谢动力学模型反馈修正流加速率。
更为具体的方法，包括如下步骤将细胞以活细胞密度为1.5～2.5×105cells/ml接种在生物反应器中，当活细胞密度达到0.8～1.2×106cells/ml后，开始补加培养基，稀释率为0.2～0.3day-1。
所说的培养基为葡萄糖限制流加培养基或谷氨酰胺限制流加培养基，葡萄糖限制流加培养基中葡萄糖和谷氨酰胺浓度分别为7.8～17.5mmol/L和6.0～10.0mmol/L；谷氨酰胺限制流加培养基中葡萄糖和谷氨酰胺浓度分别为17.5～30mmol/L和2.5～5.0mmol/L，其它成分如下表所示
培养方法采用文献(李东晓，张淑香，朱明龙，等.葡萄糖和谷氨酰胺浓度对杂交瘤细胞生长的影响，华东理工大学学报，2003，29(4)359-362.)报道的方法。控制反应器pH＝7.2±0.1，溶氧(DO)为50％空气饱和度，温度为36.8，搅拌转速120rpm。
葡萄糖限制流加培养在110～140小时间达到葡萄糖限制的拟稳态，谷氨酰胺限制流加培养在96～144小时间达到谷氨酰胺限制的拟稳态。
(b).优化的流加培养过程将细胞以活细胞密度为1.5～2.5×105cells/ml接种在生物反应器中，起始培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度分别为7.8mmol/L和2.5mmol/L。当活细胞密度达到0.8～1.2×106cells/ml后，开始补加培养基。其他条件同上。
优化的流加培养基成分如下表所示
本发明的方法具有以下优点1.广泛适用于多个细胞株或细胞系的培养；2.能够快速地达到细胞在不同环境下的拟稳态培养，便于细胞代谢规律的研究和代谢动力学模型的建立；3.建立了优化的指数流加培养模型，能够实现以调控动物细胞生理状态为直接目标的优化流加过程；4.考虑到控制系统的反馈和校正，避免了过程的发散；5.操作简便，适合于指导大规模的工业化生产。
图1为带反馈的优化流加培养控制流程图。
图2为HB58杂交瘤细胞葡萄糖限制下的流加培养的细胞生长图。
图3为HB58杂交瘤细胞葡萄糖限制下的流加培养细胞代谢图。
图4为HB58杂交瘤细胞谷氨酰胺限制下的流加培养细胞生长图。
图5为HB58杂交瘤细胞谷氨酰胺限制下的流加培养细胞代谢图。
图6为HB58杂交瘤细胞优化流加培养过程细胞生长和抗体生成图。
具体实施例方式
参见图1，初始流加速率F0根据流加点细胞的比生长速率(μ0)、活细胞密度(X0)、培养体积(V0)、控制量谷氨酰胺的浓度(S0)、流加培养基中谷氨酰胺的含量(Sin)和取样间隔(Δt)等量确定。一般的流加过程中只需等间隔时间取样，计数细胞密度(Xv)，即可确定下一次的流加速率。另外，为了进一步提高整个过程的稳定性，取样时同时测定氨浓度(CNH3)，计算此时氨的比生成速率(qNH3)，根据该细胞的代谢动力学模型(CGlnBioreactor＝f(qNH3))可确定此时培养环境中谷氨酰胺的浓度(CGlnBioreactor)。根据控制量谷氨酰胺的控制浓度(CGlnSetpoint)，进一步获得修正的流加速率(FiModified)。
根据试验阶段获得的该细胞株(系)在优化流加过程中的相关规律，进一步指导实际生产阶段，避免实际应用阶段过于频繁的间隔取样。
符号说明上述各个符号的定义说明如下Gluc——葡萄糖Gln——谷氨酰胺C——底物或产物的浓度D——释率F——流加速率(Feeding rate，ml/day)P——产物q——底物(产物)的比消耗(生成)速率Sin——流加培养基中的底物t——时间V——反应器体积Xv——活细胞(Viable cells，106cells/ml)Yx/s——胞对底物的产率μ——细胞的比生长速率实施例1～2(a).代谢规律研究用本发明所述的方法对HB58杂交瘤细胞(ATCC)在葡萄糖限制或谷氨酰胺限制培养条件下的生理状态进行研究。在Biostat B(德国B.BRAUN公司)2升生物反应器中接种，接种密度2.0×105cells/ml。当活细胞0密度达到1.0×106cells/ml后开始流加培养，稀释率为0.30day-1，培养时间分别为125小时和100小时，实现了葡萄糖限制(见图2和图3)和谷氨酰胺限制的拟稳态培养(图4和图5)，可以用来研究当细胞处于相应状态下时的代谢规律。整个培养过程中反应器搅拌转速为120rpm，温度为36.8℃，溶氧为50％空气饱和度。
葡萄糖限制流加培养基的组分和浓度如下
谷氨酰胺限制流加培养基的组分和浓度如下
图2中，曲线1代表活细胞，曲线2代表死细胞，曲线3代表比生长速率，曲线4代表稀释率；图3中，曲线5代表葡萄糖，曲线6代表乳酸，曲线7代表丙氨酸，曲线8代表谷氨酰胺，曲线9代表氨；图4中，曲线10代表活细胞，曲线11代表死细胞，曲线12代表比生长速率，曲线13代表稀释率；图5中，曲线14代表葡萄糖，曲线15代表乳酸，曲线16代表丙氨酸，曲线17代表谷氨酰胺，曲线18代表氨；实施例3～4(b).高密度优化流加培养将HB58杂交瘤细胞(ATCC)用本发明所述的方法进行优化流加培养。在Biostat B(德国B.BRAUN公司)2升生物反应器中，活细胞接种密度为2.0×105cells/ml。起始培养基中葡萄糖和谷氨酰胺浓度分别为7.8mmol/L和2.5mmol/L，其它氨基酸浓度为DMEM/F12(1∶1)培养基的原始浓度。当活细胞密度达到1.0×106cells/ml后，开始根据细胞需求指数地补加培养基。流加稀释率为0.30day-1。
流加培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度分别为100mmol/L和33mmol/L，氨基酸为DMEM/F12(1∶1，质量比)培养基质量的6.5倍。整个培养过程中反应器搅拌转速为120rpm，温度为36.8℃，溶氧为50％空气饱和度。
优化的流加培养基具体的组分和浓度如下
流加培养过程中最大活细胞密度达到5.66×106cells/ml，单抗浓度达到379mg/L(见图6)，与普通培养基批培养的结果相比，分别提高了2.9倍和3.1倍。在培养过程中，葡萄糖和谷氨酰胺稳定维持在较低的浓度，其中葡萄糖浓度在0.5mmol/L以下，谷氨酰胺浓度保持在0.1-0.2mmol/L之间，代谢副产物得到了较好的控制，氨浓度最高为4.4mmol/L。
图6中，曲线19代表活细胞，曲线20代表总细胞，曲线3代表抗体。
权利要求
1.一种系统的流加培养方法，用于动物细胞的代谢规律研究和优化悬浮培养，其特征在于，包括如下步骤(a).根据批培养细胞生长代谢动力学设计初始培养基、流加培养基和流加过程，实现不同的拟稳态培养环境，研究细胞在不同状态下的代谢规律，确定优化的控制目标；建立细胞的代谢动力学模型；根据细胞的代谢动力学确定优化的流加培养基成分比例；(b).根据设备的操作参数和(a)中获得的优化的培养基成分比例，确定优化的培养基组成。流加过程中调控细胞生理状态处于优化的控制目标，同时，根据取样获得的细胞密度和培养环境中氨的浓度，反馈修正流加速率，避免系统的发散。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括如下步骤将细胞以活细胞密度为1.5～2.5×105cells/ml接种在生物反应器中，当活细胞密度达到0.8～1.2×106cells/ml后，开始补加培养基，稀释率为0.2～0.3day-1；所说的培养基为葡萄糖限制流加培养基或谷氨酰胺限制流加培养基；葡萄糖限制流加培养基中葡萄糖和谷氨酰胺浓度分别为7.8～17.5mmol/L和6.0～10.0mmol/L；谷氨酰胺限制流加培养基中葡萄糖和谷氨酰胺浓度分别为17.5～30mmol/L和2.5～5.0mmol/L，其它成分如下表所示
葡萄糖限制流加培养在110～140小时间达到葡萄糖限制的拟稳态，谷氨酰胺限制流加培养在96～144小时间达到谷氨酰胺限制的拟稳态。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括如下步骤将细胞以活细胞密度为1.5～2.5×105cells/ml接种在生物反应器中，起始培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度分别为7.8mmol/L和2.5mmol/L，当活细胞密度达到0.8～1.2×106cells/ml后，开始补加优化的流加培养基；优化的流加培养基成分如下表所示
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的动物细胞包括杂交瘤细胞、CHO、NS0、BHK或293细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所采用到的培养基均为无血清培养基。
全文摘要
本发明公开了一种动物细胞流加培养方法。首先设计不同的流加过程，实现不同的拟稳态培养环境，确定优化目标和建立代谢动力学模型。根据代谢动力学模型，进行以优化调控细胞生理状态为目标的培养过程。同时，等时间间隔取样并检测氨的浓度，根据代谢模型估算控制量谷氨酰胺的浓度，反馈修正流加速率，避免系统的发散。本发明的方法能够快速、准确地对细胞株(系)进行代谢规律研究；根据本发明中带反馈修正的优化流加模型，能够实现培养基使用效率高、细胞密度和产物浓度高、稳定性和可控性强的细胞培养过程。根据本发明的方法，能够迅速建立动物细胞大规模优化流加培养过程，对生物制品的生产具有重要的意义。
文档编号C12N5/12GK1772883SQ20051003035
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月10日 优先权日2005年10月10日
发明者谭文松, 牛红星, 朱明龙, 周燕, 华平, 顾小华 申请人:华东理工大学