专利名称：口腔粘膜细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于个人家庭健康保健和/或医药用口腔粘膜脱落细胞采集与保存的试剂盒技术领域。
背景技术：
在我国，口腔癌的发病率约占全部恶性肿瘤的3％，而在印度、菲律宾、巴西和斯里兰卡等发展中国家发病率较高，可占全部恶性肿瘤的25％。近年来，口腔癌发病率和病死率在我国及美国、日本、法国和德国等国家均呈上升趋势，因此，口腔癌的化学预防研究具有重要意义。口腔粘膜白斑是WHO认定的口腔癌前病变，其癌变率为7％～15％，非均质型白斑可达15％～40％。因此，阻断口腔粘膜白斑的发展和恶变是预防口腔癌的重要措施。白斑癌变可经历几年到几十年，问题是如何确定这些病损的转归，因此，许多学者开始致力于口腔白斑癌变标志物的研究。口腔粘膜脱落细胞微核是近年来国外研究较多的标志物。研究表明，口腔白斑患者病损区脱落粘膜细胞微核细胞率增高，由于脱落粘膜细胞取材方便，对机体无损伤性，所以在以口腔白斑为研究对象进行的口腔癌干预试验研究中已被广泛用于反映DNA损伤的中间生物学终点。
不仅如此，对于临床其它疾病和生物分子检测，同样由于脱落粘膜细胞取材方便，对机体无损伤性，体细胞的取样也可使用脱落粘膜细胞。
现行的口腔粘膜脱落细胞的取样，一般用竹制刮板或普通棉签刮取口腔粘膜细胞，然后送到实验室进行检测。这对于专业人员，如医生、专门的研究人员来说没多大问题，但是对于普通人或样本不能及时处理的情况来讲，就存在很多弊端。首先，普通的竹制刮板或棉签刮取效果不佳，需要反复多次才能采集到足够检测用的脱落细胞，而且，是否刮取到足够的量，无法目测辨别，也没有其他定性识别采样量的办法，只有等到实验室检验结果出来才能了解先前的口腔粘膜脱落细胞取样量是否满足实验室要求的量，从而无法保证普通人自行采样的有效性。其次，现有的使用方法有将粘有口腔粘膜细胞的竹制刮板或普通棉签放在塑料袋里进行保存，再送至医院进行检验。一般来说，送样过程需要一段时间。现有的使用方法也有在医院里进行采样，但即使在医院里采样者进行了采样，医院的检验人员也不一定能及时把此样品进行核酸检测或是进行样品保存处理，这样，棉签和细胞样本就很容易腐败变质，使得样品中的DNA被酶解，导致核酸结构不完整，无法达到试验要求。再者，对于实验室检验而言，实验室检验人员希望不同的采样者相对集中地送样，以便相对集中地进行样品的核酸检测。但是由于不同采样者，通常是普通人，送样时间不同，就使得样品不能相对集中，为了不耽搁样品处理时间，即保证样品不腐败变质，实验室检验人员不得不针对少量样品做一次检测。这样就浪费了实验室检测的效率，增大了批量检测的成本。另外，现有的方法都是就医者去医院排队，医护人员依次发放刮取棒进行采样，如果就医者较多送样比较集中的时候，医院实验室门口就很喧嚣杂乱，医院要进行管理很可能需要进行场所扩建或另外安排现场管理人员，提高了医院的成本；另一面，对于就医者来说，长时间的排队非常不方便，杂乱的现场也使就医者不舒服。
发明内容
本发明的目的就是克服以上不足，提供一种口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒。
本发明所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒，由外包装盒、外包装盒内的口腔粘膜脱落细胞采集管、核酸预提取并稳定保存管和口腔粘膜脱落细胞采集棒组成，其中口腔粘膜脱落细胞采集管装有透明等渗溶液，核酸预提取并稳定保存管装有核酸提取液。
其中所说的口腔粘膜脱落细胞采集棒可以是各种材质和形状，只要方便刮取口腔细胞并消毒无菌即可，如普通的棉签、竹制刮板等。为了提高刮取效率，可以是带齿的、带网格纹的、或凹凸点的采集棒，目的是为了增加口腔粘膜细胞刮取的摩擦力。材料可以是木质、竹制、金属、橡胶或塑料等多种类型。
透明等渗溶液的作用是将采集棒上的细胞洗下来，并根据等渗溶液的透明状况判断刮取的细胞是否够量。为了使细胞在等渗溶液内仍能保持渗透压平衡，不致招到破坏，这里所用的等渗溶液可以是生理盐水、复方乳酸氯化钠溶液、5％的葡萄糖溶液、林格氏液、PH缓冲液等。采集棒上的细胞洗过后，如果等渗溶液变得浑浊，则可判断刮取的细胞足量；如果等渗溶液任然清澈，则继续用采集棒刮取，在等渗溶液内清洗，直至等渗溶液变浑浊。这样就免去了细胞样本到达实验室检测阶段才知道不够用而重新取样的麻烦。为了便于观测，装等渗溶液的容器要求透明，玻璃或塑料制品均可，但都需要消毒无菌。透明等渗溶液本身也进行过符合医药条件的消毒处理。
核酸提取稳定液的作用是初步提取核酸，使细胞裂解，释放出核酸，同时又要使核酸制品结构完整，不降解。为了满足这个条件，核酸提取液必须使细胞内特定酶和其它的杂蛋白迅速变质、失活，如核酸酶、内切酶、外切酶等；同时还需满足对核酸不具有氧化、降解作用等。因此符合条件的核酸提取液可以是1)4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸钠；2)6M盐酸胍，20mM Tris-HCl(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸钠；3)6M异硫氰酸胍，20mM Tris-HCl(pH7.0)；4)6M NaI，10mM Tris-HCl(pH7.0)。
将核酸提取液倒入洗脱液内即可制得核酸预提取稳定液，并可稳定保存。这种核酸预提取稳定液可在0℃以下长期保存，也可在0℃以上50℃以下保存14天以上，便于常温条件下递送和运输。这种核酸预提取稳定液在送达实验室后，可进一步纯化获得高纯度、高质量的基因组DNA，可适用于PCR扩增检测，基因克隆、突变检测，SNP分析及临床检测操作等。
本发明的有益效果1、本发明所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒，刮取口腔粘膜脱落细胞非常方便，由于使用特定的带有齿状或网格状的刮取棒，刮取效率高，效果好；而且，对于普通人就可目测定性判断采集的细胞是否足量用作检测，满足了实验室DNA检测对于样品量的要求，避免了重新取样。
2、由于样品得到及时处理，制成核酸预提取稳定液，可在常温保存两周左右DNA无损伤，满足试验要求，方便运输和储存，也为试验人员进行批量检测提供了技术条件。
3、所有操作不需要专业知识，对于普通老百姓来说在家里就可完成，可随时进行取样；对于医院来说，可接收病人在家里自行采集的细胞样本进行集中处理，节约了人力和场所；对于整个检测过程而言，本发明的采样不需要在医院实验室完成，样品的核酸预提取并稳定保存在进入实验室之前就已经完成，从而改变了检测的流程，提高了检测的效率，医患双方都非常方便，因此，具有很好的市场推广价值。
图1为本发明所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒结构示意图。
图2为本发明所述的口腔粘膜脱落细胞表明具有凹凸点结构的采集棒。
图3为PCR扩增的电泳结果。
具体实施例方式
如图1所示，在外包装盒1内放置有两个透明的可密封的容器，一个是口腔粘膜脱落细胞采集管2，另一个是核酸预提取并稳定保存管3，外包装盒1内还放置有口腔粘膜脱落细胞采集棒4。口腔粘膜脱落细胞采集管2内装有等渗溶液，核酸预提取并稳定保存管3内装有核酸提取液。
使用时，用采集棒4刮取口腔粘膜脱落细胞，然后放入口腔粘膜脱落细胞采集管2内洗脱，直到口腔粘膜脱落细胞采集管2内的等渗溶液变混浊，将核酸预提取并稳定保存管3内的核酸提取液倒入口腔粘膜脱落细胞采集管2内并混匀，制得核酸预提取稳定液，密封。这样试剂盒就可以送至实验室检测用。
下面以几个具体的试验例来说明本发明所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒的使用和应用效果。
实验例1～4让受试者在家里使用本发明所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒，受试者分别是10个儿童，20个成年男女和10位老人。受试者是儿童组的为试验例1，20个成年男女组分别为试验例2和3，老人组的采集细胞样本为试验例4。具体的试验样品和条件参数见表一。
将得到的四组核酸预提取稳定液送至实验室，可以用96孔板的方式纯化基因组DNA，如用Axygen公司脱落细胞96-DNA纯化试剂盒按操作指南提取纯化DNA，具体方法是1.4000rpm低速离心30秒，将核酸预提取稳定液管盖上溶液离心到管中。
2.将管转移至65℃水浴中，加热10分钟，再Vortex 30秒。置冰水浴中温育5分钟。
3.在每管中加入4℃预冷的300μLBuffer M-B，拧紧螺旋盖管，用力摇匀，或Vortex混合均匀。
4.4℃、12000×g离心5分钟。
5.将96孔过滤板置于2.2ml深孔板上。吸取700μl上清并转移至96孔过滤板中，盖上塑料盖，3000rpm离心3分钟。(注意如微量过滤器中仍然残留液体，提到离心力再离一次。)6.弃96孔过滤板。在2.2ml深孔板的滤液中加200μl含0.5％冰乙酸的异丙醇。
7.将96-DNA制备板置于废液盒上。用8道或12道移液器吸注2.2ml深孔板中的液体两次，使溶液充分混合。将混合液转移到在96-DNA制备板中，将96-DNA制备板置于2.2ml深孔板上，盖上塑料盖，3000rpm离心3分钟。
8.将96-DNA制备板连同2.2ml深孔板一起取出。取下塑料盖，在96-DNA制备板的每孔中加500μlBuffer W1A，盖上塑料盖，3000rpm离心3分钟。
9.弃2.2ml深孔板，将96-DNA制备板转移到新的2.2ml深孔板上。取下塑料盖，在96-DNA制备板的每孔中加800μl Buffer W2，盖上塑料盖，1500×g离心1分钟。
10.弃2.2ml深孔板中的溶液。将96-DNA制备板置回到2.2ml深孔板上。取下塑料盖，加800μl Buffer W2，盖上塑料盖，6000rpm离心10分钟。
11.仔细将DNA制备板转移到96-V形底板上，在膜中央加60μl水或洗脱液，室温静置1分钟。6000rpm离心5分钟收集DNA。
12.用硅胶片封上各孔。取样时只要用枪头硅胶片中央的十字处扎破即可。
也可以用单管的方式纯化基因组DNA，如用Axygen公司脱落细胞DNA纯化试剂盒按操作指南提取纯化DNA，具体方法是1.4000rpm低速离心30秒，将管盖上溶液离心到管中。
2.将管转移至65℃水浴中，加热15分钟，再Vortex 30秒。置冰水浴中温育5分钟。
3.在每管中加入4℃预冷的300μl Buffer M-B，拧紧螺旋盖管，用力摇匀，或Vortex混合均匀。
4.4℃、12000×g离心5分钟。
5.将微量过滤器置于2ml微量离心管中。吸取700μl上清并转移至微量过滤器中，6000×g离心1分钟。
注意如微量过滤器中仍然残留液体，提到离心力再离一次。
6.弃微量过滤器。在2ml微量离心管的滤液中加200μl含0.5％冰乙酸的异丙醇，混合均匀。
7.将步骤6中的混合液转移到在DNA制备管中，将DNA制备管置于2ml微量离心管中，6000×g离心1分钟。
8.弃2ml微量离心管中的溶液，将DNA制备管置回2ml微量离心管中。加500μl BufferW1，6000×g离心1分钟。
9.弃2ml微量离心管中的溶液，将DNA制备管置回2ml微量离心管中。加700μl BufferW2，6000×g离心1分钟。
10.弃2ml微量离心管中的溶液，将DNA制备管置回2ml微量离心管中。加400μlBuffer W2，12000×g离心1分钟。
11.仔细将DNA制备管转移到新的1.5ml微量离心管中(勿使2ml微量离心管中溶液溅到DNA制备管上)，在膜中央加60μl水或洗脱液，室温静置1分钟。12000×g离心1分钟收集DNA。
除Axygen公司的产品可用于上述基因组DNA纯化外，Qiagen公司的产品及其它公司的类似产品，以及实验室常规的碱法小量制备DNA方法都能从本发明的核酸预提取稳定液中纯化出高质量的基因组DNA。
表一
四组核酸预提取稳定液的受试条件见表二。
表二
所提取出来的基因组DNA紫外分光光度计测定见表三。
表三
PCR检测对样品进行PCR检测一.PCR反应体系20μl体系10×buffer 2uldNTP(2.5mM) 1.6ul3’primer(10uM) 0.8ul5’primer(10uM) 0.8ulrTaq(5u/ul，TAKARA) 0.2ulDNA模板 1ul加Mili-Q水至 20ul二.PCR反应条件1.PCR引物GAPDHGAPDH-F5’-ggg AAg gTg AAg gTC ggA gTC-3’GAPDH-R5’-CTg ATg ATC TTg Agg CTg TTg-3’PCR条件94℃1min
72℃ 5min4℃ forever电泳结果见图3，表示四组核酸预提取稳定液的PCR扩增出现了4条清晰的条带，结果为阳性。四组核酸预提取稳定液均达到DNA检测的试验要求，检测结果见表四。
表四
对比例另找10个成年男女用普通棉签刮取口腔粘膜脱落细胞，其中5个棉签在未作处理后的3～5天腐败变质，所携带的粘膜细胞全部受损无法满足试验检测要求。另外五个及时做处理进行PCR扩增试验，平均可满足十几次的扩增。
由表三可见，利用本发明所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒，所得到的核酸预提取和稳定液可满足1000次以上PCR扩增(根据稀释的倍数推算)。这种DNA制品主要是人的基因组DNA，可以满足对遗传基因检测的需要(如Snp检测)，以反映个体对疾病易感性、药物耐受性等要求，且使用方便。
权利要求
1.一种口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒，由外包装盒、外包装盒内的口腔粘膜脱落细胞采集管、核酸预提取并稳定保存管和口腔粘膜脱落细胞采集棒组成，其中口腔粘膜脱落细胞采集管内装有透明等渗溶液，核酸预提取并稳定保存管内装有核酸提取液。
2.如权利要求1所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒，其特征在于，所说的透明等渗溶液是指生理盐水、复方乳酸氯化钠溶液、5％的葡萄糖溶液、林格氏液或PH缓冲液。
3.如权利要求1所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒，其特征在于，所说的核酸提取液是1)4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠(pH7.0)和0.5％十二烷基肌氨酸钠；2)6M盐酸胍、20mM Tris-HCl(pH7.0)和0.5％十二烷基肌氨酸钠；3)6M异硫氰酸胍和20mM Tris-HCl(pH7.0)或4)6M NaI和10mM Tris-HCl(pH7.0)。
4.如权利要求1所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒，其特征在于，口腔粘膜脱落细胞采集管和核酸预提取并稳定保存管是指可密封的透明、无菌的玻璃或塑料容器。
5.如权利要求1所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒，其特征在于，所说的口腔粘膜脱落细胞采集棒是指木质、竹制、金属、橡胶或塑料等材质制备的带齿、网格纹或凹凸点的采集棒。
全文摘要
本发明属于个人家庭健康保健和/或医药用口腔粘膜脱落细胞采集与保存的试剂盒技术领域。本发明所述的口腔粘膜脱落细胞自行采集与核酸预提取并稳定保存的试剂盒，由外包装盒、外包装盒内的口腔粘膜脱落细胞采集管、核酸预提取并稳定保存管和口腔粘膜脱落细胞采集棒组成，其中口腔粘膜脱落细胞采集管装有透明等渗溶液，核酸预提取并稳定保存管装有核酸提取液。本发明所述的试剂盒，对于普通人就可目测定性判断采集的细胞是否足量用作检测，避免了重新取样，并且可在家里完成，对医患双方都非常方便，具有很好的市场推广价值。
文档编号C12Q1/68GK1943517SQ20051003031
公开日2007年4月11日 申请日期2005年10月8日 优先权日2005年10月8日
发明者应康 申请人:上海联众基因科技研究院, 应康