专利名称：一种表达可溶性trail蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及生物活性蛋白的表达方法，尤其涉及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)蛋白的表达方法。
背景技术：
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducingligand，简称TRAIL)是新近发现的TNF家族成员之一，又称凋亡素二配体(apoptotin 2ligand，Apo-2L)。1996年，Piti首先分离和鉴定了TRAIL及其诱导的凋亡，发现人TRAIL基因全长1769bp，定位于染色体3q26。TRAIL蛋白是一种II型跨膜蛋白，由281个氨基酸组成，分子量为32.5kD，等电点7.63，其C末端的第114-281位氨基酸构成胞外区，分子量为24kD左右，是主要发挥功能的部位。TRAIL的生物学活性形式是同源三聚体，其单体界面上存在锌离子结合位点(Sarah G等，Biochem，2000，39633-640)。
TRAIL胞外区与其特异性受体的结合能迅速诱导多种肿瘤细胞系的凋亡而对正常组织细胞无凋亡诱导作用，引起人们的广泛关注，是一种具有很大潜力的用于肿瘤治疗的生物调节剂。Walczak和Ashkenazi等人在鼠和猴子身上所做的临床前研究取得了良好的治疗效果。无论是TRAIL单独治疗还是与化疗药物合用，均取得了与细胞株一致的结果，即引起肿瘤的退化，生长变慢，甚至出现肿瘤消失现象，没有严重的副作用。随着研究的深入，人们还发现TRAIL在抗病毒免疫等过程中扮演重要的角色。
重组DNA技术的发展使许多稀有的人源药物蛋白的大规模生产成为可能。这些蛋白中许多天然形式是非糖基化的，而分子量较小的非糖基化蛋白生产一般首选大肠杆菌表达系统。然而，大肠杆菌体系高表达的重组蛋白很容易形成没有活性的包涵体，为了使包涵体转化成具有生物活性重组蛋白，必须将包涵体溶解(解折叠)后复性。由于包涵体复性通常复性率较低而过程复杂，因而包涵体复性一直是困扰科学界和工业界的难题，也在某种程度上限制了大肠杆菌表达系统的应用。因此，从重组蛋白产业化发展的角度看，减少包涵体的形成和提高重组蛋白的可溶性表达，将会推动基因工程蛋白药物生产的发展和技术进步。
第二军医大学王梁华等人利用大肠杆菌表达重组人TRAIL已经取得成功，他们构建重组质粒pBV-TRAIL，它带有氨苄青霉素抗性基因和编码人TRAIL蛋白胞外区(114-281位氨基酸)的基因，在编码基因上游受λPL启动子的控制，在42℃下能诱导人TRAIL蛋白的表达。所表达的TRAIL 20％左右为可溶性而直接有活性，70％～80％呈包涵体，包涵体复性率不高。
因此，本领域迫切需要改进可溶性TRAIL蛋白的表达技术，解决TRAIL蛋白作为抗肿瘤药物研究、开发中的技术难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用大肠杆菌表达TRAIL蛋白的方法，以克服现有技术中包涵体含量高，可溶性TRAIL蛋白含量低的问题。
发明人认为，对于温度诱导型表达系统，热诱导系统的转录效率受解阻遏温度的影响，随着解阻遏温度的上升，诱导强度加大，合成的重组蛋白容易凝聚形成包涵体。反之，如果在较低的温度诱导，通过降低重组蛋白的合成速率，有利于形成可溶性重组蛋白。同样，添加适宜浓度的抑制原核细胞蛋白质合成的抗生素，包括氯霉素、四环素等，也可以降低重组蛋白的合成速率，有利于可溶性重组蛋白的表达。
另一方面，基于TRAIL蛋白三聚体界面的顶部附近埋藏着一个二价金属离子(锌离子)结合位点，发明人设想添加二价金属离子锌有利于TRAIL蛋白的正确折叠，形成具有活性，以可溶性形式存在的重组蛋白。
本发明的构思是这样的在TRAIL蛋白诱导表达阶段，通过降低诱导表达温度、添加低浓度抗生素等手段，控制蛋白质的合成速率，或者在培养基中添加促进TRAIL蛋白稳定性的锌离子，降低包涵体的形成，获得高比例的可溶性TRAIL蛋白。
本发明公开了一种表达可溶性TRAIL蛋白的方法，将TRAIL胞外区(114-281位氨基酸)基因克隆到含有λ噬菌体PL启动子的表达载体中，在适当的宿主菌表达，诱导表达温度为37-41℃。
本发明不局限于特定的表达载体，只要该表达载体含有PL启动子；TRAIL胞外区基因与表达载体按常规方法重组，形成重组表达载体，本发明不限于特定的重组方式，只要将PL启动子和TRAIL胞外区基因可操作的连接；重组表达载体可按常规方法导入适宜的宿主细胞，本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能表达所述重组表达载体。在一个具体的实例中，表达载体选用pBV220原核表达载体，宿主菌选用Escherichia coli C600(supeE44 hsdR thi-1thr-1 leuB6 lacY1 tonA21)。
在一个优选的方案中，公开了一种表达可溶性TRAIL蛋白的方法，将TRAIL胞外区基因克隆到含有λ噬菌体PL启动子的表达载体中，在适当的宿主菌表达，诱导表达温度为37-41℃，优选38℃；同时在培养基中加入二价锌离子，二价锌离子选用硫酸锌、氯化锌、碳酸锌、醋酸锌中的一种，添加的锌离子的浓度为0.1mmol/L至5.0mmol/L，优选1mmol/L。
在另一个优选的方案中，公开了一种表达可溶性TRAIL蛋白的方法，将TRAIL胞外区基因克隆到含有λ噬菌体PL启动子的表达载体中，在适当的宿主菌表达，诱导表达温度为37-41℃，优选38℃；在培养基中加入抑制原核细胞蛋白质合成的抗生素，抗生素选自氯霉素、四环素、卡那霉素、庆大霉素中的一种或几种的组合；优选氯霉素或/和四环素，其中氯霉素浓度为0.1-10μg/mL，更优选1μg/mL，四环素浓度为1-20μg/mL，更优选8μg/mL。
本发明的有益效果体现在在pBV-TRAIL/Escherichia coli C600表达体系中，按常规在42℃下能诱导表达，其可溶性部分低于总表达量的20％，大部分的TRAIL蛋白以无活性的包涵体形式存在。
本发明在38℃低温诱导表达，与通常的42诱导表达相比，可溶性TRAIL蛋白表达量提高50％以上，包涵体蛋白量低于总表达量的30％；在38℃低温诱导，加入锌离子方案中，与通常的42诱导表达相比，可溶性TRAIL蛋白表达量提高100％以上，包涵体蛋白量低于总表达量的20％；在38℃低温诱导，加入氯霉素、四环素方案中，与通常的42诱导表达相比，可溶性TRAIL蛋白表达量提高70％以上，包涵体蛋白量低于总表达量的10％。
可见，本发明的表达方法提高了可溶性TRAIL蛋白的表达，大大降低了以包涵体形式存在的目的蛋白的比例。
图1、诱导温度为38℃和42℃时表达的总TRAIL蛋白和可溶性TRAIL蛋白的SDS-PAGE比较图谱。
1、38℃全菌裂解液 2、38℃上清液3、42℃全菌裂解液 4、42℃上清液图2、38℃诱导前添加1mmol/L锌离子和42直接诱导时表达的总TRAIL蛋白与可溶性TRAIL蛋白的SDS-PAGE比较图谱。
1、38℃、1mmol/L锌离子全菌裂解液2、38℃、1mmol/L锌离子上清液3、42℃全菌裂解液 4、42℃上清液图3、38诱导前添加0.75mmol/L锌离子和42℃直接诱导时表达的总TRAIL蛋白与可溶性TRAIL蛋白的SDS-PAGE比较图谱。
1、38℃、0.75mmol/L锌离子全菌裂解液2、38℃、0.75mmol/L锌离子上清液3、42℃全菌裂解液 4、42℃上清液图4、38℃诱导前添加8μg/mL四环素和42直接诱导时表达的总TRAIL蛋白与可溶性TRAIL蛋白的SDS-PAGE比较图谱。
1、38℃、8μg/mL四环素全菌裂解液2、38℃、8μg/mL四环素上清液3、42℃全菌裂解液4、42℃上清液图5、38℃诱导前添加8μg/mL四环素、4μg/mL四环素、0.6μg/mL氯霉素、1μg/mL氯霉素和42℃直接诱导时表达的总TRAIL蛋白与可溶性TRAIL蛋白的比较图。
1、38℃、8μg/mL四环素总TRAIL蛋白、可溶性TRAIL蛋白；2、38℃、4μg/mL四环素总TRAIL蛋白、可溶性TRAIL蛋白；3、38℃、0.6μg/mL氯霉素总TRAIL蛋白、可溶性TRAIL蛋白；4、38℃、1μg/mL氯霉素总TRAIL蛋白、可溶性TRAIL蛋白；5、42℃直接诱导时表达。
具体实施例方式
本发明所说的“TRAIL蛋白”指天然TRAIL的胞外区，即天然TRAIL中114-281位氨基酸组成的部分；TRAIL胞外区基因指编码TRAIL(114-281位)氨基酸的cDNA序列。本发明所说的“可溶性TRAIL蛋白”指在诱导表达后菌体中产生的以可溶性、活性形式存在的TRAIL蛋白，与之相对应的是以包涵体形式存在的、非活性的TRAIL蛋白。
本发明所说的温度诱导型表达系统包括含有λ噬菌体PL启动子的表达载体，以及相对应的含有λ噬菌体温度敏感型阻遏物基因(cIts857的cI+大肠杆菌。当转化菌在28-30℃生长时，温度敏感基因cIts857产生的阻遏蛋白(即λ温度敏感型阻遏子)与操纵基因结合，阻止PL启动子的转录，因此菌体大量产生。若将温度升高(一般为42℃)，阻遏蛋白失活，RNA聚合酶结合到λPL启动子上，启动外源基因的高效转录和表达。
本发明所说的“可操作的连接”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导肽)DNA就是可操作的连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。
本发明中表达质粒pBV220-TRAIL的构建见中国专利CN 02110880.3，表达载体pBV220-TRAIL即CN 02110880.3公开的pBV-Apo-2L I100；pBV220-TRAIL转化按常规CaCl2转化法转化到宿主菌C600中，获得了重组菌C600-TRAIL。
氨苄青霉素购于Genebase公司，氯霉素、四环素购于Sigma公司，蛋白胨、酵母粉购于OXOID公司，其他试剂为国产分析纯试剂。
下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、以42℃作为诱导温度诱导表达TRAIL蛋白重组大肠杆菌菌株C600-TRAIL在30℃下30mLLB培养基中活化后，按1％的接种量接种至30mLLB培养基中30培养，接种前均需加入氨苄青霉素至浓度为100μg/mL。培养至OD600为0.58，将摇瓶放入42℃的摇床中诱导4小时，生长期和诱导期转速均为200rpm。
其中LB培养基成份为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L氯化钠，pH调至7.0。
将上述诱导后的菌体离心后弃上清，用TE缓冲液(Tris·HCl 20mM/L，EDTA1Mm/L，pH8.5)重悬洗涤以除去菌体中夹带的未利用完的培养基组分等杂质，离心并弃上清液，再重复洗涤一次。加入20mLTE缓冲液将菌体重悬，混合均匀后，利用超声破碎菌体(功率300W，工作时间3S，间隙时间3S，共150次)，使重组TRAIL蛋白从菌体中充分释放出来，继而通过离心分离，得到的上清。上清液和全菌裂解液进行SDS-PAGE电泳，经扫描电泳图谱进行目标产物定量，结果上清液中可溶性TRAIL蛋白占上清总蛋白的3.5％，低于总TRAIL蛋白表达量的20％，见图1，图中，尖头所指位置即为TRAIL蛋白条带。
实施例2、以38℃作为诱导温度诱导表达TRAIL蛋白重组大肠杆菌菌株C600-TRAIL在30℃下30mLLB培养基中活化后，按1％的接种量接种至30mLLB培养基中30℃培养，接种前均需加入氨苄青霉素至浓度为100μg/mL。培养至OD600为0.60，将摇瓶放入38℃的摇床中诱导8小时，生长期和诱导期转速均为200rpm。
其中LB培养基成份为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L氯化钠，pH调至7.0。
按实施例1相同的方法处理菌体，对上清液和全菌裂解液进行SDS-PAGE电泳，扫描电泳图谱进行目标产物定量，见图1。与通常的42℃诱导表达相比，以38℃作为诱导温度，可溶性表达量提高50％以上，包涵体蛋白量低于总表达量的30％。
实施例3、38度诱导、添加1mmol/L锌离子提高重组TRAIL蛋白的可溶性表达用该重组大肠杆菌菌株C600-TRAIL在30℃下30mLLB培养基中活化后，按1％的接种量接种至30mLLB培养基中，30℃下培养，接种前均需加入氨苄青霉素至浓度为100μg/mL。培养至OD600为0.585，在无菌条件下添加二价锌离子至浓度1mmol/L，将摇瓶放入38℃的摇床中进行诱导，生长期和诱导期转速均为200rpm，诱导8小时。
其中，LB培养基成份为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L氯化钠，pH调至7.0。采用ZnSO4水溶液。
按实施例1相同的方法处理菌体，对上清液和全菌裂解液进行SDS-PAGE电泳，扫描电泳图谱进行目标产物定量，见图2，图中，尖头所指位置即为TRAIL蛋白条带。与通常的42℃诱导表达相比，可溶性表达量提高150％以上，包涵体蛋白量低于总表达量的20％。
实施例4、38度诱导、添加0.75mmol/L锌离子提高重组TRAIL蛋白的可溶性表达用该重组大肠杆菌菌株C600-TRAIL在30℃下30mLLB培养基中活化后，按1％的接种量接种至30mLLB培养基中，30℃下培养，接种前均需加入氨苄青霉素至浓度为100μg/mL。培养至OD600为0.55，在无菌条件下添加二价锌离子至浓度0.75mmol/L，将摇瓶放入38℃的摇床中进行诱导，生长期和诱导期转速均为200rpm，诱导8小时。
其中，LB培养基成份为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L氯化钠，pH调至7.0。采用ZnSO4水溶液。
按实施例1相同的方法处理菌体，对上清液和全菌裂解液进行SDS-PAGE电泳，扫描电泳图谱进行目标产物定量，见图3。，图中，尖头所指位置即为TRAIL蛋白条带。与通常的42℃诱导表达相比，可溶性表达量提高100％以上，包涵体蛋白量低于总表达量的20％。
实施例5、38度诱导、添加抑制蛋白合成的四环素提高重组TRAIL蛋白的可溶性表达用该重组大肠杆菌菌株C600-TRAIL在30℃下30mLLB培养基中活化后，按1％的接种量接种至两份30mLLB培养基中，30℃下培养，接种前均需加入氨苄青霉素至浓度为100μg/mL。两份培养物分别培养至OD600分别为0.530、0.562，在无菌条件下添加四环素至浓度为4μg/mL、8μg/mL。将摇瓶放入38℃的摇床中进行诱导，生长期和诱导期转速均为200rpm，诱导8小时。
其中，LB培养基成份为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L氯化钠，pH调至7.0。抗生素采用水溶液形式添加。
按实施例1相同的方法处理菌体，对上清液和全菌裂解液进行SDS-PAGE电泳，扫描电泳图谱进行目标产物定量，如图4、5，图4中，尖头所指位置即为TRAIL蛋白条带。与通常的42℃诱导表达相比，可溶性表达量提高70％以上，包涵体蛋白量低于总表达量的10％。
实施例6、38度诱导、添加抑制蛋白合成的氯霉素提高重组TRAIL蛋白的可溶性表达用该重组大肠杆菌菌株C600-TRAIL在30℃下30mLLB培养基中活化后，按1％的接种量接种至两份30mLLB培养基中，30℃下培养，接种前均需加入氨苄青霉素至浓度为100μg/mL。两份培养物分别培养至OD600分别为0.498、0.515，在无菌条件下添加氯霉素至浓度为0.6μg/mL、1μg/mL。将摇瓶放入38的摇床中进行诱导，生长期和诱导期转速均为200rpm，诱导8小时。
其中，LB培养基成份为10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L氯化钠，pH调至7.0。抗生素采用水溶液形式添加。
按实施例1相同的方法处理菌体，对上清液和全菌裂解液进行SDS-PAGE电泳，扫描电泳图谱进行目标产物定量。如图5。图中，1代表总TRAIL蛋白，2代表可溶性TRAIL蛋白；与通常的42℃诱导表达相比，可溶性表达量提高70％以上，包涵体蛋白量低于总表达量的10％，特别是添加1μg/mL氯霉素时，几乎不产包含体蛋白。
权利要求
1.一种表达可溶性TRAIL蛋白的方法，包括将TRAIL胞外区基因克隆到含有λ噬菌体PL启动子的表达载体中，在cI+宿主菌中表达，其特征在于，诱导表达温度为37-41℃；其中cI+指来自λ噬菌体的温度敏感型阻遏物基因(cIts857)；cI+宿主菌指含有cIts857基因并能正确表达的大肠杆菌菌株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，37-41℃诱导表达时培养基中加入二价锌离子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中所说的二价锌离子选自硫酸锌、氯化锌、碳酸锌、醋酸锌中的一种。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，37-41℃诱导表达时培养基中二价锌离子浓度为0.1-5.0mmol/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，37-41℃诱导表达时培养基中加入抑制原核细胞蛋白质合成的抗生素；抑制原核细胞蛋白质合成的抗生素选自氯霉素、四环素、卡那霉素、庆大霉素中的一种或几种的组合。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，优选的抑制原核细胞蛋白质合成的抗生素为氯霉素或/和四环素，其中氯霉素浓度为0.1-10μg/mL，四环素浓度为1-20μg/mL。
7.如权利要求1-6的任一项所述的方法，其特征在于，表达载体选用pBV220，宿主菌选用Escherichia coli C600。
全文摘要
本发明公开了一种表达可溶性TRAIL蛋白的方法。包括将TRAIL胞外区基因克隆到含有λ噬菌体PL启动子的表达载体中，转化cI
文档编号C12P21/02GK1778914SQ20051003035
公开日2006年5月31日 申请日期2005年10月10日 优先权日2005年10月10日
发明者沈亚领, 魏东芝, 孙爱友, 汤亚南, 周文瑜 申请人:华东理工大学, 上海恰尔生物技术有限公司