专利名称：一种可溶性珠蛋白的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术和农业领域；更具体地，本发明涉及一种可溶性珠蛋白的制备方法。
背景技术：
日前，我国屠宰业规模日渐扩大，屠宰畜禽生产肉食品的同时，产生大量的羽毛、 血液、内脏、蹄壳等副产物，这些巨大的资源如不能合理及时的利用或处理，不仅引起环境污染，还将导致资源的严重浪费。我国畜禽副产物动物血资源年产近230万吨。目前和过去相当长的时间内，大部分畜禽动物鲜血被采集用于加工全血粉，同时还有相当一部分血液因屠宰规模小等原因而被随意排放，造成环境污染。全血粉加工主要是采集凝血块(在血池中捞取)，通过蒸煮、压榨或暴晒、烘干等传统方法，再经粉碎而成。这一传统的生产工艺存在三大缺点第一，全血利用不全。由于生产过程中仅收集凝血块，因而许多血清中的营养物质被白白丢弃。第二，严重的环境污染。捞取血凝块后剩余血液成份的直接排放，以及落后的压榨、暴晒工艺使生产过程中形成的污水、腐臭均可造成环境污染。第三、产品功效及可利用度低。传统工艺生产使血液功效和可消化吸收率大大降低，血液应有的价值未能得到充分发挥。国内在近几年内，有部分企业开始关注动物血的深度开发，主要是将全血经抗凝、 分离后直接喷雾干燥工艺生产血浆蛋白粉和血球蛋白粉初级产品，部分质量指标虽然能替代国外同类进口产品，但因起步相对较晚，国内仅有一家公司能将动物血同时开发成低灰份血浆蛋白粉、高粘度蛋白、珠肽粉、免疫球蛋白、血红素等系列产品(图1)。故国内在动物血的综合利用开发上整体上还有一定的差距，工艺相对落后、产品相对单一，特别是利用动物血开发功能性产品，差距更大。综上，本领域迫切需要开发方便快捷、利用率高的动物血处理方法，充分合理利用动物血资源，减少环境污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可溶性珠蛋白的制备方法。本发明的另一个目的是提供所述方法获得的珠蛋白的用途。在本发明的第一方面，提供一种珠蛋白的制备方法，所述的方法包括步骤(a)将血球在水中破细胞膜，得到破膜的血红蛋白液体，去除细胞膜，获得去膜的血红蛋白液；(b)将去膜的血红蛋白液与无机酸混合，使PH为1 4，搅拌，得到血红素与珠蛋白混合液I ；(c)将混合液I与活性炭混合、搅拌，得到混合液II ；
(d)将混合液II进行至少一次(1-5次，较佳地2-3次)的微滤，得到透过液；微滤用膜分子量为10士2万(较佳地10士1万)单位；(e)将透过液进行纳滤脱盐，得截留液V ；纳滤所用膜分子量为200单位；所述的截留液V即为珠蛋白溶液。在一个优选例中，所述的血球来源于动物。在另一优选例中，所述的动物是畜。在另一优选例中，步骤(a)中，将血球在水中破细胞膜的方法是将血球与2-5倍体积(较佳地2-4倍体积，更佳地3倍体积)的水混合，搅拌处理1-3小时，得到破膜的血红蛋白液体。在另一优选例中，所述的血球为新鲜健康血球。在另一优选例中，血球和水的重量比为1 2-5，以混合物总重量计，血球浓度为 5-10% (w/v)。在另一优选例中，所述水为纯水。较佳地，所述水为自来水经200分子量纳滤膜过滤的水(透过滤膜的为水)。在另一优选例中，步骤(a)中，通过离心去除细胞膜，所述离心采用碟片式离心机，转速8000-11000转/分钟，细胞膜从下端排渣口排出。在另一优选例中，排渣时间为10-20分钟/次。在另一优选例中，所述的无机酸选自(但不限于)柠檬酸、盐酸。在另一优选例中，所述的无机酸是盐酸。在另一优选例中，所述的无机酸为安全实用、质优价廉型无机酸。在另一优选例中，步骤(b)中，将去膜的血红蛋白液与无机酸在30_40°C搅拌6-12 小时，得到血红素与珠蛋白混合液I。在另一优选例中，所述的无机酸是盐酸。在另一优选例中，步骤(c)中，将混合液I与活性炭混合，于40-50°C搅拌6-14小时，得到混合液II ； 所述活性炭添加量为血球体积的1-8 %，即10-80公斤/吨血球。在另一优选例中，所述的活性炭目数在40-100之间。在另一优选例中，所述的活性炭为制糖用活性炭。在另一优选例中，步骤(d)包括(dl)将混合液II进行微滤，得透过液III与截留液；(d2)用稀的无机酸(如浓度在0. 01-0. 05% (w/v))稀释截留液，使PH为1 4， 再次进行微滤，得透过液IV;(d3)合并透过液 III、IV。在另一优选例中，稀释截留液的稀释倍数为按照体积1 3倍。在另一优选例中，步骤(a)之前，还包括步骤将抗凝全血进行分离，得到血浆和血球，分离获得其中的血球。在另一优选例中，还包括步骤(f)将截留液V进行喷雾干燥，得珠蛋白(可溶性珠蛋白)的固体。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了将全血加工成各种功能性物质的流程示意图。图2显示了本发明的制备珠蛋白的方法的流程示意图。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，开发了一种基于活性炭吸附技术与微滤技术，从血球中分离纯化珠蛋白的新方法。所述方法可大规模地生产珠蛋白，方便快捷，成本低廉，且产品得率高。本发明的方法有利于血资源的回收利用，避免了资源的浪费，且有效减少了环境污染。本发明公开了一种珠蛋白的制备方法，包括步骤(a)将血球在水中破细胞膜，得到破膜的血红蛋白液体，离心去除细胞膜，获得去膜的血红蛋白液；(b)将去膜的血红蛋白液与无机酸混合、搅拌，得到血红素与珠蛋白混合液1(无机酸用于调节PH值，调节至PH为1 4)；(c)将混合液I与活性炭混合、搅拌，得到混合液II ；(d)将混合液II进行至少一次(1-5次，较佳地2-3次)的微滤，得到透过液；微滤用膜分子量为10士2万(较佳地10士1万)单位；(e)将透过液进行纳滤脱盐，得截留液V ；纳滤所用膜分子量为200单位；所述的截留液V即为珠蛋白溶液。原料本发明所述的血球来源于任何体内具有血液的生物，包括动物或禽类等。本领域人员均了解，哺乳动物或禽类等的血液成分是非常相似的，因此任何具有血液的生物都包含在本发明中。来源于各种血液的血球均可作为本发明中生产珠蛋白的原料。所述的畜例如(但不限于)猪、牛、羊、兔、狗等。较佳地，采用新鲜健康的血球作为生产珠蛋白的原料。从血液中分离出血球及血球的破膜处理是本领域技术人员熟知的技术，本发明对此不作特别的限制。将抗凝全血进行分离，可得到血浆和血球，分离获得其中的血球，作为生产珠蛋白的原料。固液分离首先，将血球的细胞膜破碎，以分离出血球中的成分(其中包括珠蛋白)。将血球在水中破细胞膜的方法是将血球与2-5倍体积(较佳地2-4倍体积，更佳地3倍体积)的水混合，搅拌处理1-3小时，得到破膜的血红蛋白液体。加水搅拌处理可使细胞膜溶胀破裂，释放出血红蛋白。按照重量比计算，血球和水的重量比为1 2-5(w/w)；按血球与水混合物的总重量计，血球浓度为5-10% (w/v)。本发明的方法采用的水较佳地为纯水。更佳地，所述水为自来水经200分子量纳滤膜过滤的水。将血球的细胞膜通过离心的方式去除。离心后，血球的细胞膜形成沉淀，可方便地与液体通过固液分离的方法进行分离。使用的离心机的种类可以视生产的规模而定；较佳地，采用碟片式离心机，转速8000-11000转/分钟，细胞膜从下端排渣口排出。更佳地，排渣时间为10-20分钟/次。无机酸处理获得去膜的血红蛋白液之后，将血红蛋白液于无机酸混合、搅拌，得到血红素与珠蛋白混合液I。无机酸的主要作用是调节液体的PH值，在pHl 4条件下，血红蛋白中的血红素与珠蛋白分离，利于血红素被活性炭吸附。所述的无机酸是指具有安全实用、质优价廉特征的无机酸，选自(但不限于)柠檬酸、盐酸。作为一种实施方式，所述的无机酸是盐酸，所述盐酸的添加量具体需视混合液的PH值而定。作为本发明的优选方式，将去膜的血红蛋白液与无机酸在30-40°C搅拌6-12小时，得到血红素与珠蛋白混合液I。加水搅拌处理可使细胞膜溶胀破裂，释放出血红蛋白。吸附获得血红素与珠蛋白混合液I之后，混合液I与活性炭混合、搅拌。活性炭可吸附混合液I中的血红素成分，而不吸附珠蛋白；从而可使得混合液中珠蛋白以游离方式存在， 而血红素被吸附于活性炭上。较佳地，所述的活性炭的目数在40-100之间。更佳地，所述的活性炭为制糖用活性炭。作为本发明的优选方式，将混合液I与活性炭混合，于40-50°C搅拌6-14小时，得到混合液II。作为本发明的优选方式，所述活性炭添加量为血球体积的1-8%，S卩10-80公斤活性碳/吨血球。过滤获得混合液II之后，通过过滤的方式将珠蛋白与混合液中其他成分分离。较佳地所述的过滤是微滤或纳滤。微滤或纳滤的次数是至少一次。作为本发明的优选方式，通过 2次微滤和一次纳滤来进行分离纯化。作为本发明的优选方式，选择分子量为10士2万(较佳地10士1万)单位的微滤用膜，将混合液II进行微滤，得透过液III与截留液；之后用稀的无机酸(如0. 01-0. 05% (w/v)盐酸)稀释截留液，再次进行微滤，得透过液IV ；之后合并透过液III、IV得到总的透过液用于后续纯化。当然，可视所需获得的产品的纯度、质量、得率来确定微滤的次数，可进行3次或4次的微滤，合并每一次获得的透过液，这样有利于提高可溶性珠蛋白得率。之后，将微滤获得的透过液进行纳滤脱盐，得截留液V ；纳滤所用膜分子量为200 单位；所述的截留液V即为珠蛋白溶液。可视最终所需的产品状态来后续加工所述的珠蛋白溶液。从方便储藏或使用的的角度出发，优选的是将截留液V(珠蛋白溶液)进行喷雾干燥，得珠蛋白(可溶性珠蛋白) 的固体。作为本发明的一种优选实施方式，公开了一种珠蛋白的制备方法，所述的方法包括步骤(1)将血球与三倍血球体积的水混合，搅拌处理1-3小时，得到破膜的血红蛋白液体；所述的血球来自畜；所述的血球为新鲜健康血球；所述水为纯水；(2)将破膜的血球液进行离心，去除细胞膜；所述离心采用碟片式离心机，转速 8000转/分钟，下端排渣口排出物为细胞膜；
(3)将去膜的血红蛋白液与无机酸混合，于30-40°C搅拌6-12小时，得到血红素与珠蛋白混合液I ；所述无机酸可是柠檬酸、盐酸等，添加量根据PH而定。(4)将混合液I与活性炭混合，于40-50°C搅拌6_14小时，得到混合液II ；所述活性炭添加量为液体体积的1_8%，S卩10-80公斤/吨。( 将混合液II进行微滤，得透过液III与截留液；微滤用膜分子量为10万单位， 透过液为珠蛋白、无机酸，截留液为珠蛋白、无机酸与活性炭。(6)用稀酸稀释截留液，再次进行微滤，得透过液IV ；透过液为珠蛋白与酸的混合液，截留液为活性炭；(7)合并透过液III、IV，进行纳滤脱盐，得截留液V ；纳滤所用膜分子量为200，截留液为珠蛋白与少部分无机酸，透过液为无机酸。(8)将截留液V进行喷雾干燥，得可溶性珠蛋白。本发明的主要有点在于本发明的方法生产的珠蛋白有较好的起泡性、乳化性以及较高的粘度，可加工成功能性食品，也可作为一种蛋白源，或者黏合剂；本发明生产的珠蛋白还可继续加工成肽产
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ΡΠ O下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、可溶性珠蛋白的制备1(0)将猪抗凝全血进行分离，分别得血浆、血球。血球用于生产珠蛋白。抗凝全血经管式离心机(12000转/分钟)离心后，所得轻液为血浆，重液为血球，此血球液用于制备可溶性珠蛋白。(1)将2吨血球与6吨纯水混合，搅拌处理2小时，得到破膜的血红蛋白液体；所述的血球为新鲜健康血球；所述水为纯水；(2)将破膜的8吨血红蛋白液采用碟片式离心机进行离心，去除细胞膜；离心转速 8000转/分钟，下端排渣口排出物为细胞膜；(3)将15公斤盐酸(浓度38 % (w/v))与42公斤纯水混合(盐酸终浓度约为10 % (w/v))，缓慢加入去膜的8吨血红蛋白液中。于35°C搅拌6小时，得到血红素与珠蛋白混合液I ；PH约为3 ；(4)将混合液I与60公斤活性炭混合，于40°C搅拌14小时，得到混合液II ；( 将混合液II进行微滤，得透过液III与截留液；微滤用膜分子量为10万单位， 得约7吨透过液，透过液成分为珠蛋白、无机酸，截留液为珠蛋白、无机酸与活性炭；(6)将1公斤盐酸(浓度38 % (w/v))与2吨纯水混合(盐酸终浓度为0. 019 % (w/v))，添加到截留液中，溶液PH约为3，搅拌20分钟，再次进行微滤，得透过液IV ；透过液为珠蛋白与酸的混合液，截留液为活性炭；(7)合并透过液III、IV，进行纳滤脱盐，得截留液V ；纳滤所用膜分子量为200，截留液为珠蛋白与少部分无机酸，透过液为无机酸。(8)将截留液V进行喷雾干燥，得可溶性珠蛋白。结果，采用以上方法，2吨猪血球得到约550公斤可溶性珠蛋白产品，指标检测结果如表1。表 权利要求
1.一种珠蛋白的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(a)将血球在水中破细胞膜，得到破膜的血红蛋白液体，去除细胞膜，获得去膜的血红蛋白液；(b)将去膜的血红蛋白液与无机酸混合，使PH为1 4，搅拌，得到血红素与珠蛋白混合液I ；(c)将混合液I与活性炭混合、搅拌，得到混合液II；(d)将混合液II进行至少一次的微滤，得到透过液；微滤用膜分子量为10士2万单位；(e)将透过液进行纳滤脱盐，得截留液V；纳滤所用膜分子量为200单位；所述的截留液V即为珠蛋白溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血球来源于动物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，将血球在水中破细胞膜的方法是将血球与2-5倍体积的水混合，搅拌处理1-3小时，得到破膜的血红蛋白液体。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，通过离心去除细胞膜，所述离心采用碟片式离心机，转速8000-11000转/分钟，细胞膜从下端排渣口排出。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的无机酸选自柠檬酸、盐酸。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，将去膜的血红蛋白液与无机酸在30-40°C搅拌6-12小时，得到血红素与珠蛋白混合液I。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，将混合液I与活性炭混合，于 40-50°C搅拌6-14小时，得到混合液II ；所述活性炭添加量为血球体积的1_8%，即10-80公斤/吨血球。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)包括(dl)将混合液II进行微滤，得透过液III与截留液；(d2)用稀的无机酸稀释截留液，使PH为1 4，再次进行微滤，得透过液IV ；(d3)合并透过液III、IV。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)之前，还包括步骤将抗凝全血进行分离，得到血浆和血球，分离获得其中的血球。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(f)将截留液V进行喷雾干燥，得珠蛋白的固体。
全文摘要
本发明涉及一种可溶性珠蛋白的制备方法。本发明的方法基于活性炭吸附技术与微滤技术从血球中分离纯化珠蛋白，可大规模地生产珠蛋白，方便快捷，成本低廉，且产品得率高。本发明的方法有利于血资源的回收利用，避免了资源的浪费，且有效减少了环境污染。
文档编号C07K1/34GK102464711SQ20101054384
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年11月15日
发明者于伟, 成国祥, 江国永, 潘勇 申请人:上海杰隆生物制品股份有限公司