辅助鉴别具有不同胸肌系水力鸡的方法及其专用引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种辅助鉴别具有不同胸肌系水力鸡的方法及其专用引物。本发明首先提供了一种辅助鉴别具有不同胸肌系水力的鸡方法，是检测待测鸡基于特异SNP的基因型为CC基因型、CT基因型还是TT基因型，CT基因型鸡的胸肌系水力高于CC基因型；所述特异SNP为如下(a1)或(a2)：(a1)鸡基因组中序列表的序列3所示DNA自5’末端第337位核苷酸；(a2)鸡基因组中引物F和引物R的靶序列中自5’末端第337位核苷酸；引物F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；引物R为如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子。本发明对于鸡的育种具有重要意义，也对于进一步研究鸡的系水力形成机理具有重要意义。
【专利说明】
辅助鉴别具有不同胸肌系水力鸡的方法及其专用引物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种辅助鉴别具有不同胸肌系水力鸡的方法及其专用引物。
【背景技术】
[0002] 随着生活水平的提高、经济的发展，人们对于鸡肉的品质和口味的要求越来越高。 我国作为鸡肉的生产和消费大国，在一味追求产肉能力的家禽产业在发展的同时，也面临 着产肉量增加的同时所带来的肉质品质下降的觸尬境地。Andersen指出，在肌肉的加工过 程中，系水力是最重要的肉品质指标之一。Otto等人也认为系水力是衡量肉品质的最重要 指标。水分损失的同时会带来可溶性蛋白质的损失，Savage等人报道每毫升流失的水中约 含有112mg的蛋白质，同时水分损失也会造成可溶性风味物质的流失。而Luciano等指出水 分流失会带走肌肉中的血红素，对肉色造成影响。因此，水分的存在对肌肉的物理形态、风 味、肉色等都具有重要的意义。
[0003] 鉴于系水力对肌肉肉质的影响至关重要，在家禽育种工作中，希望选择系水力高 的个体留种。但鸡胸肉的系水力在活体时难以度量，只能依靠同胞或后裔测定选种。测定耗 时，且资金投入大，难应用于育种实践。因此分子标记的快速发展，为标记辅助选择的应用 提供了有利条件。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种辅助鉴别具有不同胸肌系水力鸡的方法及其专用引物。
[0005] 本发明首先提供了一种辅助鉴别具有不同胸肌系水力的鸡方法，是检测待测鸡基 于特异SNP的基因型为CC基因型、CT基因型还是TT基因型，CT基因型鸡的胸肌系水力高于CC 基因型；
[0006] 所述特异SNP为如下(al)或(a2):
[0007] (al)鸡基因组中序列表的序列3所示DNA自5 '末端第337位核苷酸；
[0008] (a2)鸡基因组中引物F和引物R的靶序列中自5'末端第337位核苷酸；
[0009] 引物F为如下(bl)或(b2):
[0010] (bl)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
[0011] (b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有 相同功能的DNA分子；
[0012] 弓丨物R为如下(b3)或(b4):
[0013] (b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
[0014] (b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有 相同功能的DNA分子。
[0015] 所述方法中，具体可采用引物F和引物R组成的特异引物对检测待测鸡基于特异 SNP的基因型。
[0016]所述方法中，具体可采用如下步骤检测待测鸡基于特异SNP的基因型：
[0017] (1)以待测鸡的基因组DNA为模板，用引物F和引物R组成的特异引物对进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物；
[0018] (2)用限制性内切酶Bfal酶切步骤(1)得到的PCR扩增产物，得到酶切产物;如果酶 切产物只有一种，且为794bp-814bp(具体可为804bp)，待测鸡为CC基因型；如果酶切产物为 两种，分别为463bp-473bp(具体可为468bp)和331bp-341bp(具体可为336bp)，待测鸡为TT 基因型；如果酶切产物为三种，分别为794bp-814bp (具体可为804bp)、463bp-473bp (具体可 为468bp)和331bp-341bp (具体可为336bp)，待测鸡为CT基因型。
[0019]所述方法中，具体可采用如下步骤检测待测鸡基于特异SNP的基因型：
[0020] (1)以待测鸡的基因组DNA为模板，用引物F和引物R组成的特异引物对进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物；
[0021] (2)用限制性内切酶Bfal酶切步骤（1)得到的PCR扩增产物，然后进行琼脂糖凝胶 电泳;如果仅在750-1000bp之间显示一条带(在250-500bp之间不显示条带），待测鸡为CC基 因型；如果仅在250-500bp之间显示一条带或两条带(在750-1000bp之间不显示条带），待测 鸡为TT基因型；如果在750-1000bp之间显示一条带且在250-500bp之间显示一条带或两条 带，待测鸡为CT基因型。
[0022]所述琼脂糖凝胶电泳具体可为3%琼脂糖凝胶电泳。
[0023]本发明还保护特异引物对甲，由两条引物组成，其扩增产物包括特异DNA分子;所 述特异DNA分子为鸡基因组中引物F和引物R的靶序列。
[0024]本发明还保护特异引物对乙，由两条引物组成，其扩增产物包括特异DNA分子;所 述特异DNA分子如序列表的序列3所示。
[0025] 本发明还保护特异引物对丙，由引物F和引物R组成。
[0026] 所述特异引物对甲、所述特异引物对乙或所述特异引物对丙的用途为:辅助鉴别 具有不同胸肌系水力的鸡。
[0027] 本发明还保护一种试剂盒，所述特异引物对甲、特异引物对乙或特异引物对丙。所 述试剂盒还可包括限制性内切酶Bfal。所述试剂盒的用途为:辅助鉴别具有不同胸肌系水 力的鸡。
[0028] 本发明还保护特异引物对甲、特异引物对乙、特异引物对丙或所述试剂盒的应用， 所述应用为辅助鉴别具有不同胸肌系水力的鸡。
[0029] 本发明还保护一种鸡的育种方法，是选择以上任一所述方法鉴别得到的CT基因型 的鸡进行育种。
[0030] 本发明发现了一个和鸡的胸肌系水力紧密相关的单核苷酸多态位点，并基于该多 态设计了特异性引物对以及用该引物对检测该多态的PCR-RFLP方法。基于该单核苷酸多态 位点的基因型与鸡的胸肌系水力显著相关。用本发明的方法，可以快速简便的鉴定待测鸡 基于该单核苷酸多态位点的基因型。应用本发明的方法可以辅助筛选具有高胸肌系水力的 鸡，具有快速、简便、可以早期筛选等优点，对于鸡的育种具有重要意义，也对于进一步研究 鸡的系水力形成机理具有重要意义。
【附图说明】
[0031] 图1为部分PCR扩增产物的电泳图。
[0032] 图2为部分Bfal酶切产物的电泳图。
【具体实施方式】
[0033] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0034] 明星肉鸡：中国农业大学动物科技学院实验鸡场。寿光鸡：中国农业大学动物科技 学院实验鸡场。北京油鸡：中国农业大学动物科技学院实验鸡场。农大褐蛋鸡：中国农业大 学动物科技学院实验鸡场。藏鸡：中国农业大学动物科技学院实验鸡场。青脚矮小型隐性白 羽鸡：中国农业大学动物科技学院实验鸡场。提及明星肉鸡的文献:杨永升、邓学梅、李宁、 傅衍、朱睦元、吴常信，MC1R是控制鸡黑色素形成的候选主效基因，生物化学与生物物理进 展，2004,31(6)，500-505。提及农大褐蛋鸡的文献:宁中华、吴常信，矮小型褐壳蛋鸡育种的 理论与实践。
[0035]实施例1、检测鸡胸肌系水力的方法的建立及其效果验证
[0036] 试验鸡群为(共计120只）：明星肉鸡鸡群(40只母鸡）、寿光鸡鸡群(20只母鸡）、北 京油鸡鸡群(20只母鸡）、农大褐蛋鸡鸡群(20只母鸡)和藏鸡鸡群(20只母鸡）。
[0037] 一、鸡胸肌滴水损失的测定
[0038]分别检测试验鸡群中的每个个体的胸肌的滴水损失率，具体如下：
[0039] 在140日龄时进行屠宰，取其右侧胸大肌约80-100g，称取重量(失水前的重量W1)， 再将肉样放入一个小网兜之中，将装有肉样的网兜放入一只塑料袋中并使塑料袋充满空 气，然后扎好袋口并悬挂24小时（网兜需要处于悬空状态，不能让它碰到塑料袋内壁），然后 取出肉样(取出过程同样不能使肉样碰到塑料袋内壁)称取重量(失水后重量W2)。滴水损失 率(DL) = (W1-W2)/W1 X 100%。
[0040]系水力用滴水损失率数据体现。滴水损失率越高，表示系水力越低。滴水损失率越 低，表示系水力越高。
[0041 ] 二、基因型分型
[0042]分别检测试验鸡群中的每个个体基于特异SNP的基因型，具体如下：
[0043] 1、取静脉血，提取基因组DNA。
[0044] 2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用F和R组成的引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。
[0045] F(序列表中序列1): 5 ' -TGGCATTAAGAGCGTGTAAC-3 ' ；
[0046] R(序列表中序列2) :5'-ATGAATCTCGCTGAGGTGA-3'。
[0047] PCR扩增的反应条件:95°C预变性5min;95°C变性3〇8、60°(：退火3〇8、72°(：延伸3〇8， 35个循环;72°C延伸7min;4°C保存。
[0048]结果表明，以120个个体的基因组DNA为模板均扩增得到约804bp的DNA片段。部分 个体的结果见图1，泳道M为DM2000Plus Marker，泳道1~8分别为不同个体的PCR扩增产物。 [0049]将各个PCR扩增产物进行测序，均为804bp。测序结果表明，120个个体的PCR扩增产 物均如序列表的序列3所示。PCR扩增产物中，存在一个单核苷酸多态(存在于序列3自5'末 端第337位核苷酸），为C/T变异，将该SNP命名为特异SNP。基于该特异SNP，120个个体中，54 只鸡为CC基因型，30只鸡为TT基因型，36只鸡为CT基因型。
[0050] 3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Bf al进行酶切(限制性内切酶Bfa I的识别序列与切割位点为:C/TAG)，然后进行3%琼脂糖凝胶电泳。
[0051 ] 酶切的反应体系:PCR扩增产物10yL，BfaI内切酶(NEB)0.5此，10 Xbuffer 2此，加 双蒸水至20此。酶切的反应条件:37°C、4~6h。
[0052]结果表明，120个个体的PCR扩增产物酶切后显示三种带型。部分个体的结果见图 2，M为DM2000plus; 1~3分别为不同个体的PCR扩增产物的酶切产物。
[0053] 4、步骤2的结果和步骤3的结果的联合分析
[0054] CC基因型鸡的PCR扩增产物只有一种，不能被Bfal酶切，电泳显示804bp的一条带 (位于750bp-1000bp的分子量标记之间），带型如图2的泳道2所示。TT基因型鸡的PCR扩增产 物只有一种，可以被Bfal酶切，电泳显示468bp和336bp的两条带（由于琼脂糖检测的分辨率 低，两条带并未分开，只在250_500bp的分子量标记之间出现一条带），带型如图2的泳道3所 示。CT基因型鸡的PCR扩增产物有两种，一种可以被Bfal酶切（电泳显示468bp和336bp的两 条带），另一种不能被Bfal酶切（电泳显示804bp的一条带），带型如图2的泳道1所示。
[0055]三、关联分析
[0056]对基因型与滴水损失率进行关联分析，结果如表1所示。
[0057]表1不同基因型之间滴水损失率均值的多重比较结果
[0059] 注：同行肩注无相同字母代表差异显著(p〈0.01)，有相同字母表示差异不显著(p> 0.05);结果均为该基因型所有样本的平均值。
[0060] 不同基因型的效应差异显著。CC基因型的滴水损失率显著高于CT基因型（P〈 0.01)，而TT基因型的滴水损失率与CC基因型和CT基因型的差异不显著（P>0.05)。结果表 明，CT基因型个体的胸肌系水力大于CC基因型个体。
[0061 ]实施例2、寿光鸡母鸡胸肌系水力与SNP基因型关联的检验 [0062]试验鸡群为(共计20只）：寿光鸡母鸡。
[0063] 一、鸡胸肌滴水损失的测定
[0064] 分别检测试验鸡群中的每个个体的胸肌的滴水损失率，方法同实施例1的步骤一。
[0065] 二、基因型分型
[0066]分别检测试验鸡群中的每个个体基于特异SNP的基因型，具体如下：
[0067] 1、取静脉血，提取基因组DNA。
[0068] 2、同实施例1的步骤二的2。
[0069] 结果表明，以20个个体的基因组DNA为模板均扩增得到约804bp的DNA片段。
[0070]将各个PCR扩增产物进行测序，均为804bp。测序结果表明，20个个体的PCR扩增产 物均如序列表的序列3所示。基于所述特异SNP，20个个体中，5只鸡为CC基因型，5只鸡为TT 基因型，10只鸡为CT基因型。
[0071] 3、同实施例1的步骤二的3。
[0072] 结果表明：CC基因型鸡的PCR扩增产物只有一种，不能被Bfal酶切，电泳显示804bp 的一条带(位于750bp-1000bp的分子量标记之间）；TT基因型鸡的PCR扩增产物只有一种，可 以被Bfal酶切，电泳显示468bp和336bp的两条带（由于琼脂糖检测的分辨率低，两条带并未 分开，只在250-500bp的分子量标记之间出现一条带）；CT基因型鸡的PCR扩增产物有两种， 一种可以被Bfal酶切（电泳显示468bp和336bp的两条带），另一种不能被Bfal酶切（电泳显 示804bp的一条带）。
[0073]三、关联分析
[0074]对基因型与滴水损失率进行关联分析，结果如表2所示。
[0075]表2寿光鸡母鸡群体中不同基因型之间滴水损失率均值的多重比较结果
[0077]注：同行肩注无相同字母代表差异显著(p〈0.05)，有相同字母表示差异不显著(p> 0.05);结果均为该基因型所有样本的平均值。
[0078]在寿光鸡母鸡群体中所述特异SNP的不同基因型对胸肌系水力的效应差异显著。 CC基因型的滴水损失率显著高于CT基因型(？〈0.05)，1'1'基因型的滴水损失率与0：基因型和 CT基因型的差异不显著(P>0.05)。结果表明，可以在群体中选择CT型个体，减少胸肌的滴水 损失，即提高胸肌的系水力，获得更好的胸肌品质。
[0079]实施例3、青脚矮小型隐性白羽鸡公鸡胸肌系水力与SNP基因型关联的检验 [0080]试验鸡群为(共计30只）：青脚矮小型隐性白羽鸡公鸡。
[0081] -、鸡胸肌滴水损失的测定
[0082] 分别检测试验鸡群中的每个个体的胸肌的滴水损失率，方法同实施例1的步骤一。 [0083] 二、基因型分型
[0084]分别检测试验鸡群中的每个个体基于特异SNP的基因型，具体如下：
[0085] 1、取静脉血，提取基因组DNA。
[0086] 2、同实施例1的步骤二的2。
[0087]结果表明，以30个个体的基因组DNA为模板均扩增得到约804bp的DNA片段。
[0088]将各个PCR扩增产物进行测序，均为804bp。测序结果表明，30个个体的PCR扩增产 物均如序列表的序列3所示。基于所述特异SNP，30个个体中，10只鸡为CC基因型，10只鸡为 TT基因型，10只鸡为CT基因型。
[0089] 3、同实施例1的步骤二的3。
[0090] 结果表明：CC基因型鸡的PCR扩增产物只有一种，不能被Bfal酶切，电泳显示804bp 的一条带(位于750bp-1000bp的分子量标记之间）；TT基因型鸡的PCR扩增产物只有一种，可 以被Bfal酶切，电泳显示468bp和336bp的两条带（由于琼脂糖检测的分辨率低，两条带并未 分开，只在250-500bp的分子量标记之间出现一条带）；CT基因型鸡的PCR扩增产物有两种， 一种可以被Bfal酶切（电泳显示468bp和336bp的两条带），另一种不能被Bfal酶切（电泳显 示804bp的一条带）。
[0091] 三、关联分析
[0092] 对基因型与滴水损失率进行关联分析，结果如表3所示。
[0093] 表3青脚矮小型隐性白羽鸡公鸡群体不同基因型之间滴水损失率均值的多重比较 结果
[0095]注：同行肩注无相同字母代表差异显著(p〈0.05)，有相同字母表示差异不显著(p> 0.05);结果均为该基因型所有样本的平均值。
[0096]在青脚矮小型隐性白羽鸡公鸡群体中所述SNP的不同基因型对胸肌系水力的效应 差异显著。CC基因型的滴水损失率显著高于CT基因型(P〈0.05)，TT基因型的滴水损失率与 CC基因型和CT基因型的差异不显著(P>0.05)。结果表明，可以在群体中选择CT型个体，减少 胸肌的滴水损失，即提高胸肌的系水力，获得更好的胸肌品质。
【主权项】
1. 一种辅助鉴别具有不同胸肌系水力的鸡方法，是检测待测鸡基于特异SNP的基因型 为CC基因型、CT基因型还是TT基因型，CT基因型鸡的胸肌系水力高于CC基因型； 所述特异SNP为如下(a 1)或(a2): (al)鸡基因组中序列表的序列3所示DNA自5 '末端第337位核苷酸； (a2)鸡基因组中引物F和引物R的靶序列中自5 '末端第337位核苷酸； 所述引物F为如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列1所示的单链DNA分子； (b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物R为如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子； (b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同 功能的DNA分子。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，采用所述引物F和所述引物R组 成的特异引物对检测待测鸡基于所述特异SNP的基因型。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，采用如下步骤检测待测鸡基于 所述特异SNP的基因型： (1) 以待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物F和所述引物R组成的特异引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物； (2) 用限制性内切酶Bfal酶切PCR扩增产物，得到酶切产物;如果酶切产物只有一种，且 为794bp-814bp，待测鸡为CC基因型；如果酶切产物为两种，分别为463bp-473bp和331bp-341bp，待测鸡为TT基因型；如果酶切产物为三种，分别为794bp-814bp、463bp-473bp和 331bp-341bp，待测鸡为CT基因型。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，采用如下步骤检测待测鸡基于 所述特异SNP的基因型： (1) 以待测鸡的基因组DNA为模板，用所述引物F和所述引物R组成的特异引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物； (2) 用限制性内切酶Bfal酶切PCR扩增产物，然后进行琼脂糖凝胶电泳；如果仅在750-lOOObp之间显示一条带，待测鸡为CC基因型；如果仅在250-500bp之间显示一条带，待测鸡 为TT基因型；如果在750-1000bp之间显示一条带且在250-500bp之间显示一条带，待测鸡为 CT基因型。5. 特异引物对甲，由两条引物组成，其扩增产物包括特异DNA分子;所述特异DNA分子为 鸡基因组中引物F和引物R的靶序列； 所述引物F为如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列1所示的单链DNA分子； (b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物R为如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子； (b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同 功能的DNA分子。6. 特异引物对乙，由两条引物组成，其扩增产物包括特异DNA分子;所述特异DNA分子如 序列表的序列3所示。7. 特异引物对丙，由引物F和引物R组成； 所述引物F为如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列1所示的单链DNA分子； (b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物R为如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子； (b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同 功能的DNA分子。8. -种试剂盒，包括权利要求5所述特异引物对甲、权利要求6所述所述特异引物对乙 或权利要求7所述所述特异引物对丙。9. 权利要求5所述特异引物对甲、权利要求6所述所述特异引物对乙、权利要求7或权利 要求8所述试剂盒的应用，所述应用为辅助鉴别具有不同胸肌系水力的鸡。10. -种鸡的育种方法，包括如下步骤:选择权利要求1至4中任一所述方法鉴别得到的 CT基因型的鸡进行育种。
【文档编号】C12N15/11GK105821142SQ201610347688
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】邓学梅, 葛雅琼, 秦昊, 高强
【申请人】中国农业大学