一种香菇423-9菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用
【专利摘要】本发明涉及一种香菇423?9菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用，其序列如SEQ ID NO.1所示。获得方法包括：(1)基因组DNA的提取；(2)PCR扩增反应；(3)琼脂糖凝胶电泳检测。用于鉴别香菇423?9菌株。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的香菇菌株中具有423?9菌株的专一性。
【专利说明】
一种香菇423-9菌株的特异性分子标记及其获得方法与应用
技术领域
[0001 ]本发明属于菌株分子标记领域，特别涉及一种香燕423-9菌株的特异性分子标记 及其获得方法与应用。
【背景技术】
[0002] 香燕[Lentinula edodes(Berk. )Pegler]又名花燕、香蕈、冬燕、香，属于伞菌目 口蘑科金钱菌族微香菇属。香菇是仅次于双孢蘑菇的世界第二大类食用菌。中国是香菇的 发源地，有近千年的栽培历史。香菇因其营养价值和保健价值以及独特的风味成为深受大 众喜爱的食药用菌，在民间素有"山珍之王"之称，是高蛋白、低脂肪的营养保健食品。
[0003] 香菇的栽培和生产的发展在很大程度上必须依赖菌种，它是香菇生产的前提和关 键。而菌种的选育只有依靠长期的积累才能有所收获，但是由于香菇是无性繁殖，其菌种生 产工艺具有可复制性，使得容易被仿冒，导致国内菌种同物异名、同名异物的现象普遍存 在。这给菇农和生产厂家带来极大的损失，影响他们栽培和生产的积极性，对整个香菇产业 的发展产生伤害。要想真正保护品种产权就必须先建立成熟的品种鉴定技术。另外，随着工 厂化生产的推广，对栽培菌种的要求越来越高，需要更为简便、快速、准确的菌株鉴定技术， 以保证生产。
[0004] 针对目前对于香菇菌种存在的问题，急需加强菌株鉴定技术的研究，建立方便快 捷有效的菌株鉴定体系。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇423-9菌株的特异性分子标记及其获 得方法与应用，该方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确 性高、可重复性好的优点，在收集的香菇菌株中具有423-9菌株的专一性。
[0006] 本发明的一种香菇423-9菌株(CGMCC N0.11915)的特异性分子标记，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 具体如下：
[0009] 本发明的一种香燕423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，包括：
[0010] (1)提取香菇423-9菌株的基因组DNA;
[0011] ⑵进行PCR扩增反应;其中，引物序列为：
[0012] LEpyrF-Fl150：CGCTTTATCTTTTATCTCGTGCTCAT；
[0013] LEpyrF-Rl 150:GAACGGTGTAGTAAGACAGGTAGTCA;(引物序列基于香菇423-9菌株的 py rF基因的突变位点而设计）
[0014] (3)琼脂糖凝胶电泳检测。
[0015]所述步骤（1)中的香菇423-9菌株的基因组DNA的提取方法具体为:将香菇423-9菌 株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26 °C下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器 中，-70°C冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20°C贮藏备用。
[0016] 所述改进的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法具体为:将液氮冷冻干燥的香菇菌丝 研磨成粉末，加入65 °C预热的2 X CTAB抽提液，于65 °C保温45~60min，间或轻摇混匀； 12000rpm、4°C离心10min，取上清液;在上述上清液中加入体积比为25: 24:1的酸、氯仿和异 戊醇的混合液，轻轻混勾lOmin，12000rpm、4°C离心10min，取上清液移入离心管中；在上述 离心管中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀1 Omin，12000rpm、4 °C离心 lOmin，取上清液移入新的离心管中；在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上 清液）的_20°C预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4°C离心10min，去上清;将得到的沉 淀用75vol %乙醇和10mmol/L醋酸钠洗涤2~3次，每次8000rpm，室温离心5min;加入预冷的 95vol %乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真空抽干或自然晾干;加入 lOOyLlO X TE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解;加入lyLlOmg/mL的RNaseA于37°C 水浴lh，去除RNA;将得到的DNA提取物于-20 °C冰箱贮藏备用。
[0017] 所述步骤(2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50此，包含:TaKaRa ExTaq 0.5yL，10 X Ex Taq Buffer 5yL，dNTP Mixture 4yL，模板DNA lyL，引物各lyL，双蒸水37.5yL。
[0018] 所述步骤（2)中的PCR扩增反应的反应程序为94°C5min;94°C30s，55°C30s，72°C 75s; 30 ~35 个循环；72°C lOmin; 4°C 保藏。
[0019] 所述步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳检测具体为:取PCR扩增产物5yL，与liiL加样缓冲 液混匀，点样于1 %的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染 料染色，然后在凝胶成像仪上拍照。
[0020] 本发明的一种香菇423-9菌株的应用，用于鉴别香菇423-9菌株。
[0021]本发明原理:根据香菇423-9菌株的pyrF基因突变，分析突变序列的特异性和稳定 性，建立以突变基因为分子标记的快速鉴别423-9菌株的分子生物学方法。采用特异性引物 对香菇菌株进行PCR扩增，香菇423-9菌株扩增出的DNA片段长度为1067bp的条带，其它香菇 菌株扩增出的DNA片段长度为1150bp。
[0022] 有益效果
[0023] (1)本发明方法简单，成本低，对香菇菌株pyrF基因进行PCR扩增，将得到的带型与 423-9菌株的条带进行对照，与该条带一致即为423-9菌株；
[0024] (2)本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性 高、可重复性好的优点；常规拮抗试验需要2周左右，出菇试验至少3个月的时间；本发明仅 需4天，并且在收集的香菇菌株中具有423-9菌株的专一性，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0025] 图1为香菇不同菌株pyrF基因的PCR检测；其中，M:DL2000marker; 1: L135; 2: L808; 3:庆科 20; 4:423-9; 5: ddH20。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0027] 实施例1
[0028] 1.材料:试验所使用的香菇菌株423-9(0611〇：勵.11915)由中国普通微生物菌株 保藏管理中心保藏。香菇L135、L808、庆科20菌株由中国农业微生物保藏中心食用菌分中心 保藏。
[0029] 2. PCR引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。
[0030] 表1扩增pyrF基因的PCR引物
[0032] 3.培养基：马铃薯葡萄糖培养基(H)培养基）：马铃薯20g、葡萄糖20g，加水至1L，灭 菌后使用。
[0033] 4.菌丝培养:将香菇菌株转接到马铃薯葡萄糖培养基中，25°C下避光摇瓶培养，4d 后收集囷丝。
[0034] 5.用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取香菇菌株基因组DNA:
[0035] (1)将液氮冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65°C预热的2 X CTAB抽提液，于 65°C保温45~60min，间或轻摇混匀；
[0036] (2) 12000rpm、4°C 离心10min，取上清液；
[0037] (3)在上述上清液中加入体积比为25: 24:1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混 勾lOmin，12000rpm、4°C离心10min，取上清液移入离心管中；
[0038] (4)在上述离心管中加入体积比为24 : 1的氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀 lOmin，12000rpm、4°C离心10min，取上清液移入新的离心管中；
[0039] (5)在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液）的-20°C预冷的异 丙醇，轻轻摇动5min，8000rpm、4°C离心10min，去上清；
[0040] (6)将得到的沉淀用75vol%乙醇和lOmmol/L醋酸钠洗涤2~3次，每次8000rpm，室 温离心5min;
[0041 ] (7)加入预冷的95vol %乙醇，轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心10min，弃乙醇，真 空抽干或自然晾干；
[0042] (8)加入100yL10XTE(Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；
[0043] (9)加入 lyLlOmg/mL 的 RNaseA 于 37°C 水浴 lh，去除 RNA;
[0044] (10)将得到的DNA提取物于_20°C冰箱贮藏备用。
[0045] 6.PCR克隆相关基因：
[0046] PCR扩增体系为50此，包含：TaKaRa ExTaq(5U/yL)0.5yL，10XEx Taq Buffer(Mg2+ Plus)5yL，dNTP Mixture(2.5mmol/L)4yL，模板DNA(100ng/yL)lyL，引物各lyL(见表 1)，双 蒸水（(1诎2〇)37.5此。？0?反应程序：941€5111111;94 1€3〇8,551€3〇8,721€758;30~35个循环 ； 72°C10min;4°C 保藏。
[0047] 提取香菇菌株基因组DNA后对pyrF基因进行PCR扩增，PCR结果显示香菇菌株423-9 扩增出的目的片段的长度与其他香菇菌株相比有83bp的缺失，即可确定该菌株为423-9菌 株。如图1箭头标注所示。
[0048] 7.琼脂糖凝胶电泳检测具体为：
[0049]取上述步骤中的PCR扩增产物5yL，与lyL加样缓冲液混匀，点样于1 %的琼脂糖凝 胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染色，然后在凝胶成像仪上拍 照。
【主权项】
1. 一种香菇423-9菌株的特异性分子标记，其特征在于:其序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -种如权利要求1所述的香燕423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，包括： (1) 提取香菇423-9菌株的基因组DNA; (2) 进行PCR扩增反应;其中，引物序列为： LEpyrF-Fl 150 ： CGCTTTATCTTTTATCTCGTGCTCAT ； LEpyrF-Rl150：GAACGGTGTAGTAAGACAGGTAGTCA； (3) 琼脂糖凝胶电泳检测。3. 根据权利要求1所述的一种香菇423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在 于:所述步骤（1)中的香菇423-9菌株的基因组DNA的提取方法具体为:将香菇423-9菌株转 接到马铃薯葡萄糖培养基中，25-26°C下避光摇瓶培养，4-5d后收集菌丝装入无菌容器中，-70°C冷冻保存备用；用改进的CTAB法提取基因组DNA，-20°C贮藏备用。4. 根据权利要求1所述的一种香菇423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在 于:所述步骤（2)中的PCR扩增反应的扩增体系为50yL，包含:TaKaRa ExTaq 0.5yL，10 XEx Taq Buffer 5yL，dNTP Mixture 4yL，模板DNA lyL，引物各lyL，双蒸水37.5yL。5. 根据权利要求1所述的一种香菇423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在 于：所述步骤（2)中的PCR扩增反应的反应程序为94°C5min ;94°C30s，55°C30s，72°C75s;30 ~35个循环;72°C10min;4°C保藏。6. 根据权利要求1所述的一种香菇423-9菌株的特异性分子标记的获得方法，其特征在 于:所述步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳检测具体为：取PCR扩增产物5yL，与lyL加样缓冲液混 匀，点样于1 %的琼脂糖凝胶上，于TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，用染料染 色，然后在凝胶成像仪上拍照。7. -种如权利要求1所述的香菇423-9菌株的应用，其特征在于：用于鉴别香菇423-9菌 株。
【文档编号】C12Q1/68GK105821139SQ201610325275
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】周陈力, 鲍大鹏, 茅文俊, 万佳宁, 李燕, 奚莉萍, 冯爱萍, 汪滢, 王莹, 高英女, 杨瑞恒, 龚明, 唐利华
【申请人】上海市农业科学院