控制玉米单倍体自然加倍qtl连锁的分子标记及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记，由bnlg1380和bnlg1792两对引物组成，以待测玉米总DNA为模板，用引物bnlg1380和bnlg1792进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后，获得分子标记多态性数据；如果扩增产物具有与分子标记bnlg1380和bnlg1792相同的目的条带，则可判断待测玉米含有单倍体雄花育性恢复基因，单倍体自然恢复为二倍体的概率较高；如果扩增产物不具有与分子标记bnlg1380和bnlg1792相同的目的条带，则可判断单倍体自然恢复为二倍体的概率很低。相对于现有技术，本发明通过分子标记的检测可以预测玉米产生的单倍体雄花自然加倍的能力，从而省去了化学加倍烦琐复杂的过程，提高单倍体加倍效率，加速单倍体育种技术的工程化应用。
【专利说明】
控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于玉米遗传育种和分子生物学技术领域，具体涉及一种控制玉米单倍体 自然加倍QTL连锁的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 玉米自交系的选育是培育优良品种的核心，而传统的常规育种方法选育一个纯合 的自交系的时间大约需要花费6代左右，育种周期长，成本高，因此如何缩短育种进程、提高 育种效率是育种家们一直追求的目标。而单倍体育种技术，能大大缩短自交系的选育年限， 只需两个世代就可以获得纯合的双单倍体系(Doubled Haploid，DH)。玉米单倍体育种技术 因其环节相对独立，容易操作，可以快速实现规模化，成为我国玉米育种工程化以至现代化 的重要突破口。
[0003] 单倍体的加倍是单倍体育种技术大规模应用的关键限制因素，尤其是雄花的成功 加倍。目前，玉米单倍体常用加倍方法有化学加倍和自然加倍，化学加倍主要是利用秋水仙 素和除草剂，其加倍效果容易受药物的浓度、处理时间、辅助剂等因素的影响，浓度过高、处 理时间太长不仅加重药害，还会产生畸形现象;反之，浓度过低、处理时间太短则达不到加 倍目的。目前报道利用秋水仙素加倍的方法主要有:注射法、浸根法、浸种法和浸芽法，但每 一种方法都有不足之处，注射法对处理时期和注射部位都有一定要求，如果处理不当，将大 大影响此方法的效果;浸根法对植株伤害严重，存活率低;Gayen等采取秋水仙素浸泡单倍 体种子，结果有18%的单倍体种子加倍成功，但处理程序比较复杂。它们共有的缺点是在处 理过程中部分单倍体可能因为操作中会受到伤害导致死亡，另外化学药剂会对操作人员和 环境造成不同程度的危害，且不太适宜进行规模化操作，单倍体的自然加倍方法简单、快 捷、成本低，显现出特有的优势。
[0004] 前人研究表明，玉米单倍体雌花育性的自然恢复率可达90 %以上，但不同基因型 来源单倍体的雄花育性自然恢复率存在显著性的差异，有的材料自然加倍率可达10%左 右，有的材料不发生自然加倍，可见单倍体的雄花育性恢复与基因型有很大关联，是单倍体 自然加倍中的关键性状。吴鹏昊报道利用正反交的单倍体进行育性恢复的检测，结果 发现育性恢复率没有显著性差异，说明单倍体的育性恢复主要受核基因的控制，不受细胞 质基因的调控，并且利用郑单958F 2:3群体对单倍体雄花育性恢复进行定位，共同检测到8个 相关位点，分别位于2、3、8和9号染色体上。为了进一步提高单倍体加倍效率，优化加倍技 术，尽早检测出单倍体的自然恢复能力，筛选出有效的检测标记显得非常重要。
[0005] 分子标记辅助选择(MAS)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技 术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接 选择和表型预测。对于诱导率测定这种耗时费力的性状，可以在研究其遗传机制的基础上， 筛选出与目标性状紧密相关的分子标记来进行早期预测单倍体的自然加倍能力，以提高育 种效率。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供一种控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记 及其应用。
[0007] 本发明的目的是以下述方式实现的： 控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记，由bnlgl380和bnlgl792两对引物组成， 所述引物bnlgl380的序列为
所述引物bnlgl792的序列为：
[0008] 以待测玉米总DNA为模板，用引物bnlgl380和bnlgl792进行PCR扩增，扩增产物经 凝胶电泳分离后，获得分子标记多态性数据；如果扩增产物具有与分子标记bnlgl380和 bnlgl792相同的目的条带，则可判断待测玉米含有单倍体雄花育性恢复基因，单倍体自然 恢复为二倍体的概率较高;如果扩增产物不具有与分子标记bnlgl380和bnlgl792相同的目 的条带，则可判断单倍体自然恢复为二倍体的概率很低。
[0009 ]所述的控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记在玉米二倍体产生的单倍体 雄花育性自然恢复能力预测中的应用。
[0010] 所述的控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记在单倍体自身雄花育性自然 恢复能力预测中的应用。
[0011] 本发明通过SSR分子标记和QTL分析，在玉米第七号染色体上位于分子标记 bnlgl380和bnlgl792之间存在一个控制玉米单倍体自然加倍的QTL，它位于第七号染色体 的7.02位点，其两标记之间的遗传距离为2. lcm，分析表明该标记的有无直接关系到单倍体 玉米的自然加倍的能力，能够用于玉米单倍体自然加倍能力的预测。
[0012]相对于现有技术，本发明通过分子标记的检测可以预测玉米产生的单倍体雄花自 然加倍的能力，从而省去了化学加倍烦琐复杂的过程，提高单倍体加倍效率，加速单倍体育 种技术的工程化应用。
【附图说明】
[0013] 图1是以郑58、K22和F2群体的基因组DNA为模板，利用分子标记bnlgl380进行PCR 扩增，得到的PCR扩增产物的带型。
[0014] 图2是玉米分子遗传连锁图谱及其QTL位置图。
[0015]图3是以不同遗传背景田间自然恢复的单倍体的基因组DNA为模板，利用分子标记 bnlgl792进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物的带型。
【具体实施方式】
[0016]本发明实施过程中所用的材料来源： 郑58:河南农科院，K22:陕西省农科院，BY815:中国农业大学，87-1:河南农业大学， 4F1:四平农科所，B73:中国农业科学院。
[0017] 控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记，由bnlgl380和bnlgl792两对引物 组成，所述引物bnlgl380的序列为
所述引物bnlgl792的序列为：
[0018]以待测玉米总DNA为模板，用引物bnlgl380和bnlgl792进行PCR扩增，扩增产物经 凝胶电泳分离后，获得分子标记多态性数据；如果扩增产物具有与分子标记bnlgl380和 bnlgl792相同的目的条带，则可判断待测玉米含有单倍体雄花育性恢复基因，单倍体自然 恢复为二倍体的概率较高;如果扩增产物不具有与分子标记bnlgl380和bnlgl792相同的目 的条带，则可判断单倍体自然恢复为二倍体的概率很低。
[0019]所述的控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记在玉米二倍体产生的单倍体 雄花育性自然恢复能力预测中的应用。
[0020] 所述的控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记在单倍体自身雄花育性自然 恢复能力预测中的应用。
[0021] 实施例1:单倍体雄花育性自然加倍QTL连锁的分子标记的发现 1.制备F2代植株 利用单倍体雄花自然恢复率低的玉米自交系郑58为亲本UPD与单倍体雄花育性自然 恢复率较高的玉米自交系K22为亲本2(P2)进行杂交，得到的杂交种子为Fi代种子，将Fi代种 子进行播种得到的植株即为Fi代植株，将Fi代植株自交，得到的种子为内代种子。
[0022] 2.玉米F2:3家系群体的单倍体的性状鉴定群体的构建及单倍体雄花自然恢复率的 统计 取亲本1、亲本2和&代群体单株幼苗期(5片真叶期以后)的少量叶片，利用玉米基因组 DNA快速提取方法，提取单株基因组DNA。
[0023] ^代植株自交得到F2:3群体，种植F2:3家系的群体并利用自选的孤雌生殖诱导系进 行诱导产生玉米单倍体，就获得F2:3家系群体的单倍体的性状鉴定家系。
[0024] 2014年夏和2014年冬分别在河南郑州、海南三亚种植F2:3家系群体的单倍体，并对 单倍体雄花是否能够产生可育的花粉进行统计。
[0025] 3.遗传图谱构建及QTL分析 在两个亲本间进行多态性的标记的筛选，筛选出来的差异标记，对284个分离的^单株 玉米叶片的总DNA，采用微卫星（simplesequence repeat，SSR)分子标记引物进行PCR扩增， 扩增产物在6g/100ml聚丙烯酰胺凝胶上分离后，获得分子标记多态性数据。
[0026] PCR体系：模板DNA 20ng/yl 2yl，引物20ng/yl 1.5yl，dNTPs 0.5mmol/l 0.3yl， 10 X buff er(含MgC12) 1 ? 5yl，TaqDNA聚合酶（0 ? 5U)0 ? 2yl，ddH20 5yl，总反应体系 10 ? 5yl。 TaqDNA聚合酶购于上海生工生物工程有限公司。
[0027] PCR 反应程序为：95 °C 3min; 8 个循环 95 °C lmin，65 °C lmin，-l°C/cycle，72 °C lmin; 28 个循环 951€4586(3,581€4586(3,72°(：1111111;72°(：1〇111111 ;4°(：保存。在扩增产物中加入3111 loading buffer，95°C变性5min，4°C保存备用。
[0028]上述标记的检测方法为6%的聚丙烯酰胺凝胶检测。1XTBE为电泳缓冲液，55W的恒 定功率，电泳1小时。电泳后进行固定、银染、显影。固定方法为：在固定液（900ml蒸馏水+ 100ml乙醇+5ml冰乙酸)浸泡15-20分钟，在放银染液之前用蒸馏水清洗30秒，然后浸泡在银 染液（1.5L蒸馏水+3g AgN03) 10-15分钟；蒸馏水清洗30秒；最后浸泡显影液（1.5L蒸馏水+ 30gNa0H+7.5ml甲醛)显影5-10分钟，用清水冲洗。
[0029] 电泳之后记录分子标记多态性数据，扩增带型如图1所示，图中，1-2、7_12和15-16 (即H)为杂合带型，3和5-6(即P2)为与自交系K22-致的带型，4和13-14为（即P1)为与自交 系郑58-致的带型。表1为1 -16每个单株对应的单倍体的平均自然恢复率。 表1每个单株对应的单倍体的平均自然恢复率
[0030] 将电泳之后记录的数据利用mapmaker软件进行连锁图谱的构建，然后结合F2:3家 系群体单倍体雄花自然恢复率的表型，用WinQTLCart 2.5复合区间作图法（Composite Interval Mapping，CIM)进行QTL的扫描定位和效应估计。
[0031] 本发明应用优良自交系郑58和K22杂交得到的F2代分离群体进行分子标记连锁图 谱的构建，对F2:3家系群体进行生物诱导，所产生的单倍体群体用于雄花育性自然恢复QTL 定位，鉴定出与雄花育性自然恢复QTL紧密连锁的分子标记。
[0032] 2014年夏和2014年冬分别在河南郑州和海南三亚种植F2:3家系的单倍体并进行雄 花自然散粉率性状的调查，共鉴定了 12个QTL，其中在两地均检测到的QTL有5个，表现出大 量的QTL与环境的互作。两点的定位结果共同将QTL定位在第七染色体的7.02bin的 bnlgl792_bnlgl380区段之间，其两标记之间的遗传距离为2. lcm，附图2为分子标记与QTL 连锁情况。该QTL由来自于K22，起增效作用。
[0033] 实施例2: 利用本发明所涉及的两个标记引物对来自于K22和郑58杂交后代不同单株的DNA进行 基因检测，来判断其单倍体是否能够具有自然加倍的能力，本发明对定位群体进行基因型 检测并对其后代单倍体雄花育性进行调查，结果表明：雄花自然恢复率在40%以上的家系， 其对应的二倍体植株含K22带型的为86.27%和85.11 % (结果见表2)。 表2 F2:3家系单倍体在两地自然散粉率在40%以上的家系所对应的F2单株标记类型
1表示未含K22的带型;0表示未出带类型;3表示含有K22的类型
[0034] 实施例3: 利用本发明所涉及的两个标记引物对20株来自不同遗传背景材料田间表现出自然加 倍的单倍体DNA进行基因检测，结果表明自然加倍的单倍体中90%的单倍体植株中均含有 K22带型或与K22相同的带型（结果见表3)。利用分子标记bnlgl792检测不同遗传背景田间 自然恢复的单倍体的扩增带型如图3所示，其中，其来源分别是1 -7: BY815 X K22，8-10: K22 X87-iai-12：4FlXK22〇 表3不同遗传背景自然加倍单倍体所对应的标记类型
1表示未含K22的带型，0表示未出带，2表示来自K22或同K22相同的带型，X表示杂交
[0035]以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说， 在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的 保护范围。 SEQUENCE LISTING <110> .河南农业大学 <120>控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记及其应用 <130> 2 <160> 2 <170> Palcnlln version 3 J <210> 1 <2!1> 20 <212> DNA <213> 玉米（Zea mays L.) <400> 1 acaalicgal cgagagcgag 20 <210> 2 <21 卜 20 <212> ：D.NA 玉米（Zeamays L.) <400-> 2 ccUtcltgc [ggiicligc 20 <210> 1 <211> 20 <212> HNA <213> 玉米（ZearaaysL,) <4〇〇> 1 gcgctccltc accllclUa 20 <210> 2 <211〉 20 <212> DNA <213> . .k 米（Zea mays L.) <400> 2 egggaatgaa taagccaaga W
【主权项】
1. 控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记，其特征在于：由bnlgl380和bnlgl792 两对引物组成，所述引物bnlgl380的序列为 SEQ ID NOiFl^7- ACAATTCGATCGAGAGCGAG- 37 SEQ ID N0:R1:57- CCTTTCTTGCTGGTTCTTGC-37; 所述引物bnlgl792的序列为： SEQ ID GCGCTCCTTCACCTTCTTTA-37 SEQ ID NOiI^j'-CGGGAATGAATAAGCCAAGA-S^2. 根据权利要求1所述的控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记的方法，其特征 在于：以待测玉米总DNA为模板，用引物bnlgl380和bnlgl792进行PCR扩增，扩增产物经凝胶 电泳分离后，获得分子标记多态性数据；如果扩增产物具有与分子标记bnlgl380和 bnlgl792相同的目的条带，则可判断待测玉米含有单倍体雄花育性恢复基因，单倍体自然 恢复为二倍体的概率较高;如果扩增产物不具有与分子标记bnlgl380和bnlgl792相同的目 的条带，则可判断单倍体自然恢复为二倍体的概率很低。3. 根据权利要求1所述的控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记在玉米二倍体 产生的单倍体雄花育性自然恢复能力预测中的应用。4. 根据权利要求1所述的控制玉米单倍体自然加倍QTL连锁的分子标记在单倍体自身 雄花育性自然恢复能力预测中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105821140SQ201610327143
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】李浩川, 刘宗华, 杨继伟, 曲彦志, 汤继华, 丁冬, 付志远, 李卫华
【申请人】河南农业大学