专利名称：：农作物甲基化差异dna标记连锁图谱的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种构建植物分子标记连锁图谱的新方法，特别是一种利用甲基化差异的DNA片段作为分子标记构建连锁图谱的方法，以及其应用于农作物辅助育种。
背景技术：
：DNA甲基化是活体细胞中最常见的一种DNA共价修饰现象，是在甲基转移酶(甲基化酶)催化下将S-腺苷-甲硫氨酸上的甲基连接到DNA分子腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)碱基上，进行DNA修饰的过程。在大多数真核生物的细胞中，90%以上的甲基化作用都是发生在DNA的CpG双碱基序列处，而且这些序列大部分被对称地甲基化；在高等植物中，多数DNA甲基化发生在CpG二核苷酸对中的胞嘧啶5-碳原子上，但甲基化也常发生在CAG、CTG三核苷酸中和CCG基元中，常常是对称发生的，也有非对称序列甲基化的报道。DNA的甲基化是生物体中的表观遗传现象，即在发育过程中，虽然基因表达调控发生改变，但核苷酸序列没有变化，它可以遗传，也可能发生逆转(脱甲基化)。在高等植物中，DNA携带着两种形式的信息，即由核苷酸序列决定的遗传信息和由它的结构决定的外遗传信息。外遗传信息是不处于DNA自身的核苷酸序列中的可影响DNA活性的任何可遗传的物质，能够控制基因的表达。DNA甲基化并不改变基因的碱基序列而是通过基因的表达以改变吝功能。大量研究表明，DNA甲基化不仅可以遗传，而且存在特定的动态变化模式。DNA甲基化是调节植物基因的一种表达方式，在基因表达调控中扮演了很重要的角色。DNA的甲基化修饰参与基因表达调控，胚胎发育、细胞分化、基因组印迹、X染色体失活和细胞记忆等诸多生物学过程，DNA发生甲基化可以关闭某些基因的活性，去甲基化后又可以重新诱导基因的活化表达，在植物转基因的研究中，发现几乎所有的转基因沉默现象均与转基因及其启动子的甲基化有关，目前的研究认为发生在转基因启动子5'端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。不同生育期的植物以及植物的不同器官，由于基因表达模式的不同，会导致基因组总甲基化水平发生变化。而且不同植物在生长发育过程中甲基化水平变化的趋势不同，不同器官间甲基化水平也有差异。基因甲基化模式的改变可以影响植物的花期、育性、花及叶片的形态等。找到控制不同器官甲基化差异表达的基因，可以研究其在植物生长发育过程中的特定时空表达和调控；对DNA甲基化水平进行研究，发现许多植物在杂交种中一些位点与亲本相比表现为去甲基化，而另一些位点表现为甲基化水平增加，表明在杂交种中DNA甲基化水平的改变，导致新的基因调控系统的形成，通过与杂种优势性状的相关性分析，可进一步研究杂种优势产生的分子基础，有利于在早代就选出能产生杂种优势的亲本。DNA甲基化分子标记是DNA甲基化水平遗传变异的直接反映，为研究植物整个基因组甲基化水平的变化，利用甲基化差异的DNA片段作为分子标记构建连锁图谱很有意义。
发明内容本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种具有更直接与基因表达相关优势的农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱构建方法，并应用于农作物辅助育种。从理论上讲，根据植物不同生育期DNA甲基化的差异，可以构建不同发育时期的DNA甲基化图谱，但通过长期的育种实践工作可以发现，在植物整个基因组中发生DNA甲基化的敏感部位应该大体上是一致的，或者至少范围不会有太大变化，只是在不同时期，敏感部位发生甲基化或去甲基化存在着差异。本发明首先获得甲基化特异性DNA片断，然后根据甲基化差异片段在杂交亲本之间的异同及其在杂交、回交等后代群体中的分离状况，确定这些片段之间以及目的性状与这些分离片段之间的连锁强度。寻找与目标性状紧密连锁的甲基化差异DNA分子标记，从而构建该时期甲基化敏感的分子标记连锁图谱。本发明采用限制性内切酶一PCR方法获得甲基化差异片段。为了能够检测到尽可能多的某一发育阶段生物体基因组甲基化位点，必须将DNA基因组完全消化，从而得到完全消化的DNA甲基化差异片段，用于构建DNA甲基化的分子标记连锁图谱。DNA甲基化差异分子标记连锁图谱既可以利用已有DNA分子标记连锁图及其上的标记作为锚定标记，确定已有图谱上的标记与DNA甲基化差异标记间的距离，也可以全部采用DNA甲基化差异多态性标记单独构建。本发明将SSR标记作为锚定标记，由于其标记相对较少，只构建出高粱部分染色体连锁群，与未构建的高粱染色体连锁群相连锁的甲基化标记会单独构成连锁群，尽管目前无法确定它们与哪条染色体连锁，但随着SSR标记数目的增加，它们会被定位到相应的染色体上。选择较多的锚定引物和甲基化标记引物，在材料亲本间进行基因组多态性检测，获得较多的多态性标记，可以对甲基化遗传连锁图谱进行加密和完善。本发明农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法，是采用限制性内切酶一PCR方法获得甲基化差异片段，酶切和连接可同时进行，或者分别进行；PCR扩增方法，可采用预扩增和选择性扩增两步完成，或者一步扩增完成。本发明农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱构建方法的应用，是利用甲基化片段的差异，构建分子标记的连锁图谱，应用于育种工作中辅助对优良性状的选择，应用于与甲基化相关的功能基因的分析克隆；应用于分析与作物杂种优势相关的甲基化标记，并进一步研究作物杂种优势产生的分子机理；可以找到控制不同器官甲基化差异表达的基因，进一步研究其在植物生长发育过程中特定时空表达和调控；可以找到甲基化热点区域，分析植物不同生长发育阶段的甲基化模式，研究生物体表观遗传性状;还可分析转基因作物目的基因表达沉默的原因。本发明所使用的实验材料是高粱。选取高粱品种中强优势组合B2V4X1383-2，建立其Fi群体及衍生的F2群体。实验用高粱材料播种于山西省农业科学院高粱所实验田，出苗后约五周取上部叶子，采用PEX方法提取亲本B2V4、1383-2、F,及衍生的&群体120株单株的DNA，测定它们的浓度和纯度，稀释到400ng/ul待用；用^boRI/处al1和1/#印1两种酶切组合分别对以上高粱材料的DNA基因组进行限制性消化，酶切作为整个发明的第一步，其完成情况直接决定以后的各步实验和结果，酶切和连接同时进行，37'C反应8-10小时；根据接头和酶切位点核心序列设计预扩增引物，对以上高粱材料DNA基因组的酶切连接片断进行预扩增；在预扩增引物3'端加l-3个选择性碱基作为选择扩增引物，在高粱亲本间进行基因组多态性检测，选用多态性引物，对高粱亲本B2V4、1383-2、杂交种F,及衍生的F2群体中120株高粱材料的预扩增产物进行选择性扩增；聚丙烯酰胺凝胶电泳，1%硝酸银染色，胶干后进行带型统计分析；本实验中，以SSR标记作为锚定标记，高粱10个连锁群上分别随机选取至少10对引物，SSR引物序列从http:〃sorgblast2.tamu.edu获得，由上海生工生物工程公司合成。本实验中选取129对Xtxp系列的高粱SSR引物，运用作图软件，构建高粱的SSR分子标记连锁图谱，以SSR标记作为锚定标记，确定现有SSR图谱上的标记与DNA甲基化差异标记间的距离，构建高粱甲基化差异DNA标记的连锁图谱，本发明方法同样可用于构建其他作物的DNA甲基化的分子标记连锁图谱。实验证明，利用甲基化差异的DNA片段作为分子标记，可以构建出植物的甲基化差异片段连锁图谱。本发明利用构建的甲基化差异DNA分子标记连锁图谱，可以得到与作物优质、高产和多种抗性等优良基因连锁的甲基化位点，从而能够对许多功能基因进行分析和克隆；利用构建的甲基化差异DNA分子标记连锁图谱，通过甲基化差异片段的带型类型的统计与杂种优势性状的相关性分析，可以得到与作物杂种优势相关的甲基化分子标记，并可进一步研究杂种优势产生的分子基础；利用构建的甲基化差异DNA分子标记连锁图谱，可以找到控制不同器官甲基化差异表达的基因，研究其在植物生长发育过程中的特定时空表达和调控；利用构建的甲基化差异DNA分子标记连锁图谱，通过对不同发育时期的DNA甲基化片段分析，可以发现基因表达热点区域，对生物体表观遗传进行深入研究，并有助于解释转基因作物目的基因表达沉默的原因；利用构建的甲基化差异DNA分子标记连锁图谱，在育种工作中，还可以利用与目标性状连锁的甲基化差异DNA标记，有利于在早代就选出能产生杂种优势的亲本，由于许多甲基化标记直接与基因的表达相关，所以在辅助与杂种优势利用为目标的亲本选择上会更优于其它分子标记。本发明适用于农作物构建甲基化差异DNA标记连锁图谱，并在农作物辅助育种实践中加以应用。本发明与其它分子标记构建的遗传图谱比较具有更直接与基因表达相关的优势，应用前景更广泛。图1.高粱甲基化标记连锁图谱(&OJI/ifepI酶切组合)。图2.高粱甲基化标记连锁图谱(fcoRI/〃pall酶切组合)。图3.高粱SSR标记和甲基化标记连锁图谱(￡cMl/i&pI酶切组合)。图4.高粱SSR标记和甲基化标记连锁图谱(fcoRI/Wpall酶切组合)。具体实施例方式(一)选择实验材料，建立实验所需Fi群体及衍生的F2群体。选择高粱品种中强优势组合B2V4X1383-2，建立其h群体及衍生的F2群体。亲本B2V4和1383-2由山西省农业科学院高粱所提供。(二)提取亲本及其杂交种R群体及衍生的F2群体的DNA，测定其浓度和纯度，稀释到400ng/ul待用。采用PEX方法提取高粱亲本B2V4、1383-2、F,群体及衍生的F2群体中120株高粱的DNA。具体步骤如下(1)样本叶片在液氮中研磨后收集到2.0ml的离心管中；加入800pi提取缓冲液(PEX12.5mmol/L,TrisCl100mmol/LpH8.0，NaCl700mmol/L，EDTA10纖ol/LpH8.0)，65。C水浴1h。(2)13000rpm离心5min，取上清于新的离心管中，13000rpm再次离心5min;取上清，加入1/10体积醋酸钠(pH5.2)和lx体积的异丙醇，混匀后置-20°Clh或-75'C15min沉淀DNA。(3)13000rpm离心15min，弃上清，用70%酒精洗沉淀2次。DNA经室温风干后加适量lxTE(10mmol/LTrisCl，pH8.0，lmmol/LEDTA，pH8.0)溶解DNA，可65。C助溶15min;13000rpm离心8min，吸出上清。测定其浓度和纯度，稀释到400ng/ul待用。(三)在本实验中主要是采用限制性内切酶-PCR的方法获得甲基化差异片段，用DNA限制性内切酶和与其相对应的甲基化特异性同裂酶，分别消化高粱亲本B2V4、1383-2、h群体及衍生的F2群体中120株高粱的DNA基因组，并将相应的衔接物连接到酶切的DNA片段上。具体步骤如下(1)用fcoRI/处an和&0^1/#印1两种酶切组合分别对高粱亲本B2V4、1383-2、F,群体及衍生的F2群体中120株高粱的DNA基因组进行限制性消化^coRI识别切割G4AATTCCTTAAtG位点和#mI识别切割c}cggGGCtC位点对c甲基化敏感，如在ccgg位点上有1个或2个c被甲基化就不能识别和切割，但对半甲基化的mCCGG,能切割(一条链)；#砂1对C甲基化不敏感，能切割双链CmCGG，但不能切割mCCGG。(2)在消化的DNA片断两端分别连接上与&oRI和^7a//互补的人工接头I接头5，-CTCGTAGACTGCGTACC-3，3'-CTGACGCATGGTTAA-5'Hpall/Mspl接头5，-GACGATGAGTCCTGAG_3，3'-TACTCAGGACTCGC-5'(3)酶切和连接一步完成，也可以分成两步完成。对于每份高粱DNA样品，同时设置&0///处3//和fco///#邵/两种酶切体系。12.5ul的反应体系包含400ng样品DNA、1XT4DNA连接酶Buffer(含lmmol/LATP)、2.5ugBSA、各50pmol/L^b。yI(处a//)接头、各3ufcoyI和MspI你pa/"内切酶、1.5uT4DNA连接酶。37'C反应8-10小时。(四)PCR扩增可以采用预扩增和选择性扩增两步完成，也可以一步扩增完成。在本实验中分为两步。预扩增反应。根据接头和酶切位点核心序列设计引物对以上高粱基因组酶切连接片断进行预扩增fco)I(E)拳ll/ifepl(HM)预扩增引物5，-GACTGCGTACCMTTC-3，(E00)5，-GATGAGTCCTGAGCGGC-3，(HM01)PCR预扩增程序为94°C，1分钟；94°C，30秒；56'C，1分钟；72°C，1分钟，扩增20个循环，然后1(TC,12分钟。预扩增产物稀释20倍，用于选择性扩增。(五)选择性扩增反应根据预扩增引物设计选择性扩增引物，在预扩增引物3'端加上1-3个选择性碱基，作为选择性扩增引物。选扩增引物5，-GACTGCGTACCAATTC-3，5，-GATGAGTCCTGAGCGG-3，1MC(E32)CAA(HMll)2AAG(E33)CAC(HM12)3ACC(E36)CAG(HM13)4CAT(腿4)5CTA(腿5)6CTC(HM16)7CTG(腿7)PCR选扩增程序为94°C，2分钟；94°C，30秒；65°C，30秒；72°C，1分钟，扩增12个循环(每循环一次降0.7。C)，然后94。C，30秒；56°C，30秒；72°C，1分钟，返回第六步，23个循环，72。C延伸5分钟。(六)聚丙烯酰胺凝胶电泳在扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.025%溴酚蓝，0.025%二甲苯青)样品94。C变性5min后立即置于冰上用5%的变性聚丙烯酰胺凝胶,恒功率80W电泳1h后，取5uL样品上样，恒功率80W电泳2h后，1%硝酸银染色，胶干后进行带型统计分析。(七)带型统计在高粱实验中，以亲本的带为标准，统计杂交种F,及其衍生的F2材料的带型。最初实验记录中，有带的记录为1，无带的记录为O，不同酶切组合分别登记，为了便于应用作图软件，在软件分析中把与1383-2带型相同的变更为C，与B2V4带型相同的变更为D，缺失或模糊的带型用表示。(八)筛选多态性引物在高粱亲本间进行基因组多态性检测。H代表AcoRI/^^n酶切组合所得到的带，M代表^coyI/i&;7l酶切组合所得到的带。观察同一酶切组合中亲本和杂交种F,的带型，如该带型在亲本B2V4和1383-2间有差异，就视为多态性引物。不同引物组合可以产生不同的带型，带型类型如下图所示(有带的记为l，无带的记为0):表1.多态性引物筛选举例<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(十)运用Mapmaker/EXP3.0软件，构建遗传图谱在本实验中，我们从巳发表高粱遗传连锁图谱(http://sorgblast2.tamu.edu)中的每个连锁群上随机选取10对以上SSR标记，本实验共选取129个Xtxp系列SSR引物，将这些SSR标记作为锚定标记确定本研究中甲基化标记在各连锁群中的位置。SSR标记谱带记作A、B、H和"-"。来自母本B2V4的带记为A，来自父本1383-2的带记为B，杂合型的(父母本带同时出现)记为H，与父母本带相异的记为OFF,没有扩增出来或缺失数据记为"-"。应用Mapmaker/Exp(Version3.0)进行连锁分析后，得到高粱的SSR连锁图谱。选取不同酶切组合中多态性标记所得的数据，采用Mapmaker/Exp(Version3.0)进行连锁分析，得到甲基化标记(fco/I/i&pI和^boRIA^alI酶切组合)构建的高粱甲基化图谱(图l、图2)，与图3，图4中共有的标记用黑体标出，由于选用SSR引物多态性不高，不能很好的覆盖高粱染色体连锁群，部分甲基化标记未能与本实验中SSR标记相连锁，不能确定其属于那个连锁群。在图1和图2中以SBI-i(M)、SBI-ii(H)、SBI-iii(H)、SBI-iv(H)、SBI-v(H)和SBI-vi(H)标出该六个连锁群，随着SSR标记的增加，它们会被连锁到相应的染色体上。根据高粱的SSR连锁图谱，其上的标记作为锚定标记，选取其数据与不同酶切组合中多态性标记所得的数据，采用Mapmaker/Exp(Version3.0)进行连锁分析，确定已有图谱上的SSR标记与甲基化差异标记间的遗传距离，得到SSR标记和甲基化标记(fco/IAJfe/I和fcoRI/^oalI酶切组合)构建的高粱甲基化连锁图谱(图3，图4)，其中SSR标记用黑体标出。在图3中SBI-08连锁群上只有SSR标记，甲基化标记未与其相连锁；在图4中，只有SBI-01(H)、SBI-02-l(H)、SBI-02-2(H)和SBI-05(H)这四个连锁群上既有SSR标记又有甲基化标记，其余的连锁群均只有SSR标记，甲基化标记未与其相连锁。在图3中，观察发现在引物Xtxp96附近出现较密集的甲基化位点，可以说明该引物附近就是甲基化敏感区域，研究定位在甲基化敏感区域的特定基因，可以分析与高粱优质、高产和多种抗性等优良基因连锁的甲基化位点，从而能够对许多功能基因进行分析和克隆，甲基化热点区域的发现有助于对生物体表观遗传进行深入研究。权利要求1、一种农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法，其特征是首先获得甲基化特异性DNA片断，然后根据甲基化差异片段在杂交亲本之间的异同及其在杂交、回交等后代群体中的分离状况，确定这些片段之间以及目的性状与这些分离片段之间的连锁强度；寻找与目标性状紧密连锁的甲基化差异DNA分子标记，从而构建该时期甲基化敏感的分子标记连锁图谱。2、如权利要求1所述的农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法，其特征是采用限制性内切酶一PCR方法获得甲基化差异片段。3、如权利要求1或2所述的农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法，其特征是将DNA基因组完全消化，从而得到完全消化的DNA甲基化差异片段，用于构建DNA甲基化的分子标记连锁图谱。4、如权利要求1或2所述的农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法，其特征是酶切和连接可同时进行，或者分别进行。5、如权利要求1或2所述的农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法，其特征是PCR扩增方法，可采用预扩增和选择性扩增两步完成，或者一步扩增完成。6、如权利要求1所述的农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法的应用，其特征是可利用甲基化片段的差异，构建分子标记的连锁图谱，应用于育种工作中辅助对优良性状的选择。7、如权利要求1所述的农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法的应用，其特征是应用于与甲基化相关的功能基因的分析克隆。8、如权利要求6所述的农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法的应用，其特征是可应用于分析与作物杂种优势相关的甲基化标记，并进一步研究作物杂种优势产生的分子机理。9、如权利要求6所述的农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法的应用，其特征是可以找到控制不同器官甲基化差异表达的基因，进一步研究其在植物生长发育过程中特定时空表达和调控。10、如权利要求6所述的农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法的应用，其特征是能够找到甲基化热点区域，分析植物不同生长发育阶段的甲基化模式，研究生物体表观遗传性状，分析转基因作物目的基因表达沉默的原因。全文摘要一种农作物甲基化差异DNA标记连锁图谱的构建方法及其应用，目的是具有更直接与基因表达相关优势并应用于农作物辅助育种。本发明首先获得甲基化特异性DNA片断，然后根据甲基化差异片段在杂交亲本之间的异同及其在杂交、回交等后代群体中的分离状况，确定这些片段之间以及目的性状与这些分离片段之间的连锁强度；寻找与目标性状紧密连锁的甲基化差异DNA分子标记，从而构建该时期甲基化敏感的分子标记连锁图谱，这一方法可用于育种中辅助对优良性状的选择。文档编号C12Q1/68GK101353703SQ20081007937公开日2009年1月28日申请日期2008年9月10日优先权日2008年9月10日发明者仪治本,毅孙,梁小红,段永红,锦钱,敏闫申请人:山西大学