专利名称：甲基化分析的通用方法
甲基化分析的通用方法在整个本申请中，各种参考的出版物都用括号注明资料来源。对于这些参考文献 的完整出处可在说明书的最后，权利要求书之前找到。这些出版物的完整披露在此被作为 参考并于本申请，以便更加完整地描述与本发明有关的目前技术发展水平。
背景技术：
哺乳动物的基因组大约含有2千8百万个CpG位点，其中的60%左右在胞嘧啶的 5-位上是甲基化的(Rollins et al.，2006)。CpG较多的启动子的甲基化产生非常强烈的 转录阻遏(Stein et al.，1982，Lorincz et al.，2002)；启动子甲基化基本上被限制在印 记基因，转座子启动子，和失活的X染色体上的CpG岛(CpG islands)。许多实验已经证实 了在体细胞的许多细胞分裂(Wigler et al. ,1981 ；Lorincz et al. ,2002)以及许多植物 的有性繁殖(它们含有与脊椎动物类似的DNA甲基化系统，由Goll & Bestor在2005年综 述)有自始自终可靠的甲基化模式的遗传。这种遗传性表明基因组的甲基化模式可能具有 许多生物的功能，已经提出了许多这样的功能。这些功能中最熟悉的有在发育过程中的基 因调控(Holliday & Pugh，1975 ；Rigga, 1975)。其他提出过的功能包括基因组稳定性(Chen et al.，1998)，学习和记忆(Miller & Sweatt，2007 ；该宣称引起了很大的争论)，防御转座 子(Yoder et al.，1997 ；Bestor，2003)，以及 X 染色体失活(Panning & Jaenisch, 1996) 尽管留有很多争论，但是启动子甲基化使转录沉默的能力以及基因组甲基化模式的遗传性 还是得到大量的使人非相信不可的证据的支持。在三种DNA甲基转移酶(methyltransferases)中任意一个的无效突变是隐性 的致死因子，DNMT3L的缺失造成男性不育和女性的母性效应致死率(maternal effect lethality infemales)。DNA甲基转移酶中的基因DMNT3B的突变造成ICF综合症，它的特 征是联合免疫缺陷，往往在童年期是致命的，染色体1，9，和16的着丝粒非常不稳定，轻微 但典型的脸部异常(Xu et al.，1999)。突变型鼠的部分脱甲基化或过度甲基化导致印记基 因的不正常表达伴随早期致死率(Biniszkiewicz 2002 ；Yamade et al.，2005)。尽管哺乳 动物基因组的正常功能明显依赖于基因组的甲基化模式，但是，由于缺少整个基因组甲基 化分析(methylation profiling)的方法，在人类疾病中发现的基因组甲基化模式的异常 已经难以辨别。发明综述提供了一种化合物，它具有这样的结构
权利要求
1. 一种化合物，它具有这样的结构 ,
2.如权利要求第1项所述的化合物，其特征在于该式中的R为
3. 一种组合物，它包含具有这样结构的化合物
4 其特征在于式中的R为
5.如权利要求第3或第4项所述的组合物，其特征在于该CpG甲基转移酶为Sssl甲基 转移酶。
6.一种制备双链DNA衍生物的方法，它包含使该双链DNA与CpG甲基转移酶和具有这 样结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触
7.如权利要求第6项所述的方法，其特征在于该化学基团具有结构
8.如权利要求第6或第7项所述的方法，其特征在于该化学基团具有结构
9.如权利要求第6，7或第8项所述的方法，其特征在于该CpG甲基转移酶为Sssl甲基 转移酶。
10.如权利要求第6，7，8或第9项任意一项所述的方法，其特征在于当该能被该CpG甲 基转移酶从S-腺苷甲硫氨酸类似物上转移到该双链DNA的未甲基化的胞嘧啶的5-碳原子 上的化学基团共价地结合在该双链DNA的未甲基化的胞嘧啶的5-碳原子上时，允许该未甲 基化的胞嘧啶的4-位上发生氧化脱氨基反应。
11.如权利要求第6，7，8或第9项任意一项所述的方法，其特征在于该未甲基化的胞嘧 啶按序直接与该双链DNA的单链中的鸟嘌呤邻接。
12.一种测定存在于一双链DNA已知序列中的胞嘧啶是否是未甲基化的方法，它包括 a)通过使该双链DNA与CpG甲基转移酶和具有这样结构的s_腺苷甲硫氨酸类似物接触来制备该双链DNA衍生物
13.如权利要求第12项所述的方法，其特征在于该化学基团具有结构
14.如权利要求第12或第13项所述的方法，其特征在于该化学基团具有结构
15.如权利要求第12，13或第14项所述的方法，其特征在于该CpG甲基转移酶为Sssl 甲基转移酶。
16.如权利要求第12，13，14或第15项任意一项所述的方法，其特征在于该未甲基化的 胞嘧啶按序直接与该双链DNA的单链中的鸟嘌呤邻接。
17.如权利要求第12，13，14，15或第16项任意一项所述的方法，其特征在于当该能被 该CpG甲基转移酶从S-腺苷甲硫氨酸类似物上转移到该双链DNA的未甲基化的胞嘧啶的 5-碳原子上的化学基团共价地结合在该双链DNA的未甲基化的胞嘧啶的5-碳原子上时，允 许该未甲基化的胞嘧啶的4-位上发生氧化脱氨基反应。
18.如权利要求第12，13，14，15，16或第17项任意一项所述的方法，其特征在于，在该 步骤c)中的测序是通过合成来测序。
19.如权利要求第18项所述的方法，其特征在于，通过合成测序包括使衍生的单链与 DNA聚合酶，引物寡核苷酸，dATP，dCTP，dTTP，以及与结合有可探测标记的三磷酸双脱氧核 苷酸接触。
20.如权利要求第19项所述的方法，其特征在于该可探测标记是有放射性的或者有荧 光的。
21.如权利要求第19项所述的方法，其特征在于该可探测标记是一种mass标记物。
22.如权利要求第12-21项的任意一项所述的方法，该方法还包括将该单链在进行步 骤c)之前与固体载体相结合。
23.一种衍生的DNA分子，其特征在于，该衍生的DNA分子与DNA的区别在于它包含一 种核苷酸残基，该核苷酸残基包含具有如下结构的碱基
24. 一种衍生的DNA分子，其特征在于，该衍生的DNA分子与DNA的区别在于它包含-种核苷酸残基，该核苷酸残基包含具有如下结构的碱基
25. 一种化合物，它具有这样的结构
26.如权利要求第25项所述的化合物，其特征在于该式中的R为
27. 一种制备双链DNA衍生物的方法，它包含使该双链DNA与CpG甲基转移酶和具有这 样结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触
28.如权利要求第27项所述的方法，其特征在于该化学基团具有的结构为
29.如权利要求第28项所述的方法，其特征在于该CpG甲基转移酶为Sssl甲基转移酶。
30.一种测定存在于已知序列的双链DNA序列中的胞嘧啶是否是未甲基化的方法，它 包括a)通过使该双链DNA与CpG甲基转移酶和具有这样结构的s_腺苷甲硫氨酸类似物接 触来制备该双链DNA衍生物
31.如权利要求第30项所述的方法，其特征在于该化学基团具有的结构为
32.如权利要求第30或第31项所述的方法，其特征在于该CpG甲基转移酶为Sssl甲 基转移酶。
33.如权利要求第30，31，或第32项所述的方法，其特征在于，在其步骤c)中的测序是 通过合成来测序。
34.如权利要求第33项所述的方法，其特征在于，通过合成的测序包括使衍生的单链 与DNA聚合酶，引物寡核苷酸，dATP，dCTP，dTTP，新碱基y或新碱基Y’以及结合有可探测标记的三磷酸双脱氧核苷酸接触。
35.如权利要求第34项所述的方法，其特征在于该可探测标记是有放射性的或者有荧 光的。
36.如权利要求第34项所述的方法，其特征在于该可探测标记是一种mass标记物。
37.如权利要求第30-36项的任意一项所述的方法，该方法还包括将该单链在进行步 骤c)之前与固体载体相结合。
38.一种使双链DNA分子衍生的试剂盒，它包括 a) 一种化合物，它具有这样的结构
39.如权利要求第38项所述的试剂盒，其特征在于该CpG甲基转移酶为Sssl甲基转移
40.一种包含用于Sssl甲基转移酶的辅助因子的试剂盒，它包含 a) 一种化合物，它具有这样的结构
41. 一种化合物，具有这样的结构
全文摘要
本发明提供了衍生双链DNA的方法，包括使双链DNA与CpG甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸类似物接触。本发明也提供了对DNA测序来确定甲基化模式的方法。本发明还提供了新碱基以及利用新碱基对甲基化模式进行测序的方法。
文档编号C07H19/16GK102105483SQ200980129203
公开日2011年6月22日 申请日期2009年7月22日 优先权日2008年7月22日
发明者晓旭·李, 约翰·R·爱德华兹, 蒂莫西·H·贝斯托, 静月·居 申请人:纽约哥伦比亚大学理事会