一种三疣梭子蟹线粒体基因组甲基化位点标记检测技术的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及到一种三疣梭子蟹线粒体基因组甲基化位点标记检测技术，可以应用 于三疣梭子蟹种质鉴定、增殖放流标记等领域，是一种线粒体DNA分子标记技术。
【背景技术】：
[0002] DNA甲基化属于表观遗传学的范畴，是指生物体在不改变DNA序列的情况下，通过 对DNA序列中胞嘧啶的甲基化来调控基因表达的一种遗传调控方式。DNA甲基化主要是指 在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基（CH 3)，形成 5-甲基胞嘧啶（5-mC)或少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤（7-mG)，通过这 种修饰作用可引起染色质的结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改 变，进而导致被甲基化的生物基因失去活性，从而起到调控基因沉默或开启的作用。甲基化 后的DNA序列虽然很多情况下可以逆转，即去甲基化而恢复原状，但也可以遗传给子代，具 有一定的物种和个体特异的遗传性，因此也可以用来作为分子标记对同一物种不同群体和 个体进行识别和鉴定。而线粒体基因组中的甲基化标记，由于具有母性遗传的特点，即可以 通过母亲遗传给子代，而与父亲无关，因此在种质鉴定和增殖放流标记等方面具有更好的 应用前景。
[0003] 目前DNA甲基化分析的方法和技术很多，针对于全基因组水平的分析方法有化学 发光定量检测技术、基于DNA甲基化分析的微阵列技术、甲基免疫共沉淀、高效液相色谱 分析技术等；针对于特定基因或序列区位点的分析方法有甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)、结合亚硫酸盐限制性分析（combined bisulfite restriction analysis，COBRA)、基于Sanger法的重亚硫酸氢盐测序（BSP)、焦磷酸测序技术等。其中的 重亚硫酸氢盐测序（BSP)法是操作相对简单、结果最准确和直接的一种DNA甲基化特定位 点分析方法，此方法可以运用的前提是获得适合于特点甲基化位点分析的PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增引物。获得该特定引物序列后，就可以通过检测该引物扩增区的甲基 化特征，建立相应物种及其个体的分子标记技术。目前，三疣梭子蟹等甲壳类生物中还未 见相关甲基化位点标记的研宄报道。
[0004] 三疣梭子蟹是一类广泛分布于太平洋和印度洋海域的梭子蟹，也是我国一种重要 的捕捞和养殖经济蟹类。由于该蟹的特殊生活史特点，即需要多次脱壳才能生长，使用外部 标记或金属线码标记等物理标记技术都存在着丢失或者因阻碍三疣梭子蟹生长发育而降 低存活率的问题，相应的也会使回捕率这一数值很难精确统计，因此需要开发避开这些问 题的新标志技术；分子遗传标志技术则是其中的一个首选目标，而线粒体基因组中的分子 标记又是所有分子遗传标志中最适宜增殖放流标志的工具，因此大力开发包括甲基化位点 标记技术在内的线粒体分子标记技术是十分必要的，应用前景广阔。
【发明内容】
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[0005] 本发明描述了一种三疣梭子蟹线粒体基因组甲基化位点标记的检测技术，为三疣 梭子蟹种质鉴定和增殖放流评估提供了一个新的标记技术，主要内容为通过提取三疣梭子 蟹线粒体基因组DNA，利用重亚硫酸氢盐处理提取的线粒体基因组DNA，在此基础上设计适 合于甲基化位点扩增的PCR引物，利用该引物通过PCR方法扩增重亚硫酸氢盐处理过的线 粒体基因组DNA，对PCR扩增产物进行测序，并在测序产物中寻找甲基化位点，以此获得扩 增产物含有甲基化位点的甲基化特异性扩增引物，进而建立一个适合于三疣梭子蟹种质鉴 定和增殖放流标记操作的甲基化位点标记检测技术。
【附图说明】：
[0006] 附图是甲基化特征图。图中显示的数字"（14902)"表示该序列所在的三疣梭 子蟹线粒体基因组的序列起点为第14902bp处，图中显示的数字"（15120)"表示该序列 所在的三疣梭子蟹线粒体基因组的序列终点为第15120bp处，序列全长为219bp ;图中 " GATTTGGAGCATGGCTTGGCCTAGA "表示本专利申请的甲基化引物序列所对应的原始序列中的 上游引物序列（5'端序列），图中"GCTTTCACTCCTTCTAAAACTAGGTGCTG"表示本专利申请的 甲基化引物序列所对应的原始序列中的下游引物序列（3'端序列）；图中凡是被"框"起来 的序列，如|5??1、M?等，表示该序列中的胞嘧啶C为该序列中发生甲基化的位点。
【具体实施方式】：
[0007] 本发明可以通过以下几个操作步骤实现：
[0008] -、线粒体提取
[0009] 采用线粒体提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，产品编号SM0020-50)提取三 疣梭子蟹的线粒体，具体操作步骤如下：
[0010] (1)样本处理：称取100_200mg三疣梭子蟹附肢中的肌肉组织，用剪刀剪碎，放入 玻璃勾衆器内，然后加入2. Oml冰预冷的Lysis Buffer，0°C冰浴中上下研磨20次。
[0011] (2)将组织匀浆液转移到I. 5ml离心管中，在4°C下，IOOOg离心5min。
[0012] (3)离心结束后，取上清并把上清液转移至新的1.5ml离心管中，在4°C下，IOOOg 再次离心5min。
[0013] (4)离心结束后，取上清并把上清液转移至新的I. 5ml离心管中，在4°C下，12000g 再次离心IOmin。
[0014] (5)离心结束后，去上清，离心管底部沉淀为线粒体。
[0015] (6)在线粒体沉淀中加入0· 5mlWash Buffer重悬线粒体沉淀；在4°C下，IOOOg离 心 5min〇
[0016] (7)离心结束后，取上清，并把上清液转移至新的1.5ml离心管中；在4°C下， 12000g离心IOmin ;离心结束后，弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底。
[0017] (8)用50-100ul Store Buffer重悬浮线粒体沉淀，立即使用或-70°C保存。
[0018] 二、线粒体基因组DNA的提取
[0019] 获得三疣梭子蟹线粒体后，通过如下操作步骤提取其中的线粒体基因组DNA :
[0020] (1)蛋白酶k消化：在上述步骤（8)中获得的线粒体溶液中加入13 μ 110% SDS溶 液和4 μ 1蛋白酶K (20mg/ml)，反复倒置10次，用封口膜封住管口，在55°C水浴锅中水浴 l_3h，水浴期间，轻轻摇匀几次，直到溶液变为清澈透亮。
[0021] (2)从水浴锅中取出上述溶液，去除封口膜，冷却至室温后，在1.5ml离心管中加 入250 μ 1饱和酷，上