产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及饲料添加剂一一微生物制剂领域，具体涉及到一种产高效抗菌肽 butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 饲用抗生素在作为动物促生长剂在饲料中的广泛使用，它的弊端正日益凸现，如 导致动物胃肠道菌群失调，产生耐药性和药物残留等，对人来的健康安全产生潜在的风险。 寻找高效、绿色、安全、不易产生耐药性的饲料添加剂已成为行业关注热点之一。
[0003] 抗菌肽作为新型的安全的生物制剂已凸显其潜在的利用价值，抗菌肽是生物体内 经诱导产生的一种具有生物活性物质的小分子，这类活性多肽具有强碱性、热稳定性和光 谱抗菌等特点。由于其独特的破膜杀菌制剂，致使细胞内容物溢出胞外而死亡。
[0004] 丁酸梭菌（Clostridium butyricum)是新型的益生菌，抗逆性强，且维持动物肠道 内的微生态平衡，促进有益菌（乳酸杆菌、双歧杆菌）的增殖和生长，抑制有害菌（大肠杆 菌、沙门氏菌）等有害菌的生长繁殖；并能产酶、产维生素、产丁酸等生物活性物质而广受 关注。丁酸梭菌肽（butyrisin)是丁酸梭菌分泌的具有光谱抗菌物质，其杀菌机制为破坏 细菌的细胞膜，致使细胞膜的通透性发生改变，细胞内物质外流而致死。
[0005] 国内外对丁酸梭菌的相关研宄报道不多，研宄主要集中在将丁酸梭菌作为工程菌 用于丁酸的生产，1，3-丙二淳的生产，发酵工艺优化，及丁酸梭菌对动物的非特异性和动物 胃肠道调节上。而对丁酸梭菌以其产抗菌肽butyrisin为筛选标准进行菌种筛选尚未见报 道。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种产高效抗菌肽butyrisin 丁酸梭菌的筛选 方法。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的 筛选方法，依次进行以下步骤：
[0008] 1)、基于发酵菌液的抑菌活性进行初筛：
[0009] 以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，对待测菌株进行初筛，从而筛选出对大 肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌性的丁酸梭菌；
[0010] 所述待测菌株为从自然界分离的菌株（例如由本实验室分离自健康猪肠道）或现 有菌株（例如为可通过商业途径获得的菌株）；
[0011] 2)、通过PCR验证其抗菌肽butyrisin蛋白基因的表达，依次进行以下步骤：
[0012] ①、基因组提取；
[0013] 备注说明：细菌总DNA提取可采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒（上 海生工，SK8229)提取，按照说明书操作；
[0014] ②、PCR :
[0015] 根据已报道的分泌抗菌肽butyrisin的编码区进行引物设计，对提取的细菌基因 组进行PCR扩增；
[0016] 反应体系（50 μ L) : 10 X PCR Buffer 5 μ L ;dNTPs (各 2. 5mM) 1 μ L ;引物 F (IOuM/ μ U 1 μ L ;弓I 物 R(10uM/ μ L) 1 μ L ;基因组 DNA(50ng/ μ I) 1 μ L JaKaRa Ex taq 酶（5U/ yL)0.5yL;MgCl2(25mM)3yl ;牛血清白蛋白 BSA(10mM)2.5yl ;加双蒸水至 50yL;
[0017] PCR 扩增程序：94°C预变性 5min ;92°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 30s， 进行30cycle ;最后72°C延伸15min ;
[0018] ③、琼脂糖检测：PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测：
[0019] PCR阳性的菌株为产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌。
[0020] 作为本发明的产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法的改进：还包括步 骤3)的蛋白电泳验证抗菌肽butyrisin的表达：
[0021] 将步骤2)中PCR阳性的丁酸梭菌菌株的发酵上清液进行蛋白电泳，验证其是否表 达 8. 07KD 的 butyrisin 抗菌肽；
[0022] 蛋白电泳结果在8. 07KD处有蛋白的菌株为产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌。
[0023] 作为本发明的产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法的进一步改进：
[0024] PCR 引物为：
[0025] 引物 F: 5 ' -GCTGCTCTAACAACTTCA-3 '
[0026] 引物 R: 5 ' -TTCACCATCAGATACGG-3 '。
[0027] 备注说明：产物为159bp。
[0028] 作为本发明的产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法的进一步改进，所 述抗菌肽butyrisin蛋白序列为：
[0029] Pro Ser Ala Trp Gln He Thr Lys Cys Ala Gly Ser He Ala Trp Ala Leu Gly Ser Gly He Phe AlaGly Ala Lys Leu Leu Lys lie Lys Lys Tyr He Lys Ala Leu Gly Gly Val Lys Glu Ala Ala Ala Leu LeuLeu Gly Ala Thr Thr Trp Ala Glu Lys Met Glu Ala Gly Gly Ser Ala Leu Val Asn Leu Ala Ala Glu He Ser Gly Val Lys Asp He Lys Glu Asn Cys Phe Ser〇
[0030] 备注说明：大小为8. 07KD。
[0031] 作为本发明的产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法的进一步改进：
[0032] 所述步骤1)的初筛使用琼脂扩散法，打孔器的直径为5mm，菌液加样量为 20-50 μ L，指示菌为大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌ATCC25923,培养基为LB培养基，培养 时间为12?24小时；
[0033] 所述菌液为按1% (重量％ )接种的丁酸梭菌种子液后严格厌氧发酵（37 °C、 200rpm)24?48小时后离心（3000g 5min)，所收集的上清液；
[0034] 观察抑菌圈大小，以抑菌圈直径来间接表示抑菌活性。
[0035] 备注说明：同时分析侯选菌株的菌液上清液抗菌谱。
[0036] 备注说明：上述接种是于液体培养基（RCM液体培养基）上。
[0037] 在本发明中，步骤3)的蛋白电泳例如可按照如下方式进行：
[0038] ①、将样品离心，保留上清。
[0039] ②、样品（13 μ L)中加入样品缓冲液（5 μ L)，变性剂（2 μ L)，70°C加热15分钟，将 变性后的蛋白样品和maker加入泳道，小心溢出；
[0040] ③、200V运行30分钟，待染料分子到达凝胶底部时关闭电源；
[0041] ④、将胶体取出，双蒸水冲洗表面残留的电泳缓冲液，考马斯亮蓝R250染色2h ;
[0042] ⑤、清水脱色过夜后，用电化学发光检测系统进行拍照。
[0043] 采用本发明方法能获得产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌。
[0044] 采用本发明方法筛选所得的丁酸梭菌Fl-----丁酸梭菌（Clostridium butyricum) ZJU-Fl (保藏号CGMCC No. 8939)，其butyrisin的表达特性是在16h时分泌量 最高，32小时后开始降解。分泌的抗菌肽对E. coli ATCC25922、E. coli K88和S. aureus ATCC25923具有抑菌活性，最小抑菌浓度分别为64 μ g/mL、128 μ g/mL、64 μ g/mL。
[0045] 该ZJU-F1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研宄所，保藏日期：2014年03月20日，保藏 编号：CGMCC No. 8939,分类命名：丁酸梭菌 Clostridium butyricum。 采用本发明的方法，能获得产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌。所述抗菌肽是指对 包含但不限于的E. coli ATCC25922、E. coli K88和S. aureus ATCC25923等细菌具有抑菌 活性。
[0046] 采用本发明的方法所得的丁酸梭菌buryrisin制剂，可作为饲料添加剂从而用于 制备动物饲料。该添加剂具有调节动物肠道微生态平衡，增