强动物非特异性免疫的作用，降 低腹泻率，促进生长等作用。
【附图说明】
[0047] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0048] 图1是丁酸梭菌发酵上清液对指示菌的抑菌效果图；
[0049] A图为6株丁酸梭菌上清液对大肠杆菌K88的抑菌图谱，
[0050] B图为6株丁酸梭菌上清液对金黄色葡萄球菌25923的抑菌图谱，
[0051] C图为Fl菌株发酵上清液经不同处理对大肠杆菌K88抑菌图谱，
[0052] D图为Fl菌株发酵上清液对金黄色葡萄球菌25923的抑菌图谱。
[0053] 图2是PCR结果图。
[0054] 图3是蛋白电泳结果图。
[0055] 图4是丁酸梭菌分泌butyrisin的时间规律。
【具体实施方式】
[0056] 下面结合具体实施案例对本发明作进一步详细描述。
[0057] 下述实施案例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0058] 下述实施案例中使用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业渠道获 得。
[0059] 实施例1、产抑菌物质的丁酸梭菌初筛
[0060] 将待筛选的丁酸梭菌菌株出株）发酵培养，以仔猪腹泻常见致病菌（大肠杆菌， 金黄色葡萄球菌）为指示菌，筛选具有产对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌物质的丁 酸梭菌。
[0061] 对每株待筛选的丁酸梭菌菌株依次进行如下步骤：
[0062] (1)将菌株活化接种（1 %的接种量）于液体培养基（RCM液体培养基）于厌氧培 养箱（37°C、200rpm)培养24h，离心（3000g 5min)取上清液，检测上清液的pH值；
[0063] 利用上清液分别设置如下组别①?⑦：
[0064] ①上清液（即，上清液原液）；
[0065] ②用NaOH调节上清液至ρΗ5· 5 ;
[0066] ③先调节上清液至ρΗ7. 2,然后加入氧化氢酶至浓度达到lmg/mL (即每Iml的上清 液中加入Img的氧化氢酶）于37°C温育处理2h，最后调回pH至5. 5 ;
[0067] ④先调节上清液至pH7. 2,然后加入胰蛋白至浓度达到lmg/mL(即每Iml的上清液 中加入Img的胰蛋白酶）于37°C温育处理2h，最后调回pH至5. 5 ;
[0068] ⑤先调节上清液至pH7. 2,然后加入蛋白酶K至浓度达到lmg/mL(即每Iml的上清 液中加入Img的蛋白酶K)于37°C温育处理2h，最后调回pH至5. 5 ;
[0069] ⑥空白培养基上清液，乙酸调pH至4. 5作为对照。
[0070] ⑦空白培养基上清液，丁酸调pH至4. 5作为对照。
[0071] (2)将指示菌液体培养过夜，梯度稀释100倍（即，浓度约为108cfu/ml)，涂布LB 平板，静置30min后利用打孔器（直径为5_)打孔（每平板7孔），然后在每个孔对应无 菌操作滴加每种待测菌株所设置的上述7个组别中的每一组的50ul，静置lh，向每孔补充 同样组别直至充满孔，37°C培养过夜（12小时）。
[0072] (3)观察抑菌圈大小，以抑菌圈直径来间接表示抑菌活性。
[0073] 同时分析侯选菌株的菌液上清液抗菌谱。
[0074] 结果如图1，表1-1，表1-2所示。对6株丁酸梭菌发酵上清液经过酸排、H2O 2酶、 蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K)处理后与上清液原液相比，抑菌活性结果如表1-1，1-2所示。 各株发酵液PH较低。酸排处理后F4、F5、F6抑菌活性消失，但ph4. 5的乙酸、丁酸对照无抑 菌活性。H2O2酶处理后抑菌活性并无显著差异，胰蛋白酶、蛋白酶K处理后抑菌活性消失。 说明该抑菌作用的是蛋白质。
[0075] 表1-1 :丁酸梭菌上清液不同处理对大肠杆菌K88抑菌圈直径。
[0076]
【主权项】
1. 产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法，其特征是依次进行以下步骤： 1) 、基于发酵菌液的抑菌活性进行初筛： 以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，对待测菌株进行初筛，从而筛选出对大肠杆 菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌性的丁酸梭菌； 2) 、通过PCR验证其抗菌肽butyrisin蛋白基因的表达，依次进行以下步骤： ① 、基因组提取； ② 、PCR : 根据已报道的分泌抗菌肽butyrisin的编码区进行引物设计，对提取的细菌基因组进 行PCR扩增； 反应体系（50yL):10XPCR Buffer5yL;dNTPs (各 2.5mM)lyL;弓| 物 F(10uM/ U L) 1 U L ;弓| 物 R(10uM/ y L) 1 y L ;基因组 DNA(50ng/ y 1) 1 y L ;TaKaRa Ex taq 酶（5U/ yL)0.5yL;MgCl2(25mM)3yl ;牛血清白蛋白 BSA(10mM)2.5yl ;加双蒸水至 50yL; PCR扩增程序：94°C预变性5min ;92°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30s，进行 30cycle ;最后 72°C延伸 15min ; ③ 、琼脂糖检测：PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测： PCR阳性的菌株为产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌。
2. 根据权利要求1所述的产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法，其特征是： 还包括步骤3)的蛋白电泳验证抗菌肽butyrisin的表达： 将步骤2)中PCR阳性的丁酸梭菌菌株的发酵上清液进行蛋白电泳，验证其是否表达 8. 07KD 的 butyrisin 抗菌肽； 蛋白电泳结果在8. 07KD处有蛋白的菌株为产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌。
3. 根据权利要求2所述的产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法，其特征 是： PCR引物为： 引物 F: 5 ' -GCTGCTCTAACAACTTCA-3 ' 引物 R: 5 ' -TTCACCATCAGATACGG-3 '。
4. 根据权利要求3所述的产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法，其特征是 所述抗菌肽butyrisin蛋白序列为： Pro Ser Ala Trp Gin lie Thr Lys Cys Ala Gly Ser lie Ala Trp Ala Leu Gly Ser Gly lie Phe Ala Gly Ala Lys Leu Leu Lys lie Lys Lys Tyr lie Lys Ala Leu Gly Gly Val Lys Glu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ala Thr Thr Trp Ala Glu Lys Met Glu Ala Gly Gly Ser Ala Leu Val Asn Leu Ala Ala Glu lie Ser Gly Val Lys Asp lie Lys Glu Asn Cys Phe Ser〇
5. 根据权利要求4所述的产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法，其特征 是： 所述步骤1)的初筛使用琼脂扩散法，打孔器的直径为5mm，菌液加样量为20-50 y L，指 示菌为大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌ATCC25923,培养基为LB培养基，培养时间为12? 24小时； 所述菌液为按1 %接种的丁酸梭菌种子液后严格厌氧发酵24?48小时后离心，所收集 的上清液； 观察抑菌圈大小，以抑菌圈直径来间接表示抑菌活性。
【专利摘要】本发明公开了一种产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌的筛选方法，依次进行以下步骤：1)、基于发酵菌液的抑菌活性进行初筛：以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，对待测菌株进行初筛，从而筛选出对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌性的丁酸梭菌；2)、通过PCR验证其抗菌肽butyrisin蛋白基因的表达；PCR阳性的菌株为产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌。采用本发明的方法能获得产高效抗菌肽butyrisin的丁酸梭菌。所述抗菌肽是指对包含但不限于的E.coli ATCC25922、E.coli K88和S.aureus ATCC25923等细菌具有抑菌活性。CGMCC No.893920140320
【IPC分类】C12Q1-04, C12Q1-18, C12Q1-68
【公开号】CN104611411
【申请号】CN201410532784
【发明人】汪以真, 王腾浩, 宗鑫
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年10月11日