一种无创癌症检测方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种无创癌症检测方法及其试剂盒。更具体地，本发明涉及一种通过 高通量测序无创检测血浆DNA特定区域，特别是基因组重复区的甲基化水平用于癌症检测 的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着测序技术进步，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，费用更 低、通量更高、速度更快、可完成全基因组测序的高通量测序技术应运而生。高通量测序技 术的核心思想是高通量的边合成边测序，即通过捕捉新合成末端的标记来确定DNA的序 列，现有的技术平台主要包括 R〇che/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、Applied Biosystems SOLID 和 life Technologies/Ion Torrent/Proton 等。以 Illumina 产品为例，HiSeq2000 目前每个run可以达到6个人基因组30X覆盖的测序通量，约600G/run数据，上机操作时 间也减少到了 30分钟。而且随着高通量测序技术的成熟，将其应用于临床检测的研究迅猛 发展。实践表明通过测序孕妇血浆DNA可以判断胎儿遗传健康状况，使得无创产前检测领 域快速发展，而测序检测者血浆DNA可以进行癌症早期筛查，并具有很强的应用前景。
[0003] 血浆DNA又称循环DNA，是血液中的细胞外DNA，长约几十到几百核苷酸（主峰约 167bp)，可以以DNA-蛋白质复合物的形式存在，也可以是游离的DNA片段。正常情况下，血 浆DNA来源于衰老死亡细胞的DNA释放。健康状态下，循环DNA的生成与清除处于动态平 衡状态，维持在较恒定的低水平，ImL血浆正常人约含有2000个基因组DNA的量。循环DNA 能反映人体内细胞新陈代谢的状况，是健康评判的一个重要指标。外周血循环DNA量和质 的改变与多种疾病（包括肿瘤、复合性严重外伤、器官移植、妊娠相关疾病、感染性疾病、器 官功能衰竭等）关系密切，作为一种无创性检测指标，有望成为某些疾病早期诊断、病情监 测、疗效及预后评估的一种重要的分子标志物。本发明所述的无创是指相对于组织监测，如 组织活检和手术等方法，本发明不需要对受试者造成实质性创伤。
[0004] 研究发现，癌症病人的癌细胞凋亡产物（包括断裂游离的癌细胞DNA)会释放到 的血液中，随血液循环系统运送到全身，血浆DNA中携带有癌细胞基因组的全部遗传信息 (Schwarzenbach，Hoon et al. 2011)。通过高通量测序挖掘血楽游离DNA中的癌细胞基因组 信息，是目前实现无创癌症检测及实时监测的主要途径。而研究结果也揭出癌细胞基因组 表现出低于正常的细胞的甲基因化水平（Feinberg and Vogel steinl983 ;Ushijima2005 ; Ross，Rand et al. 2010)，甲基化水平应可以反映出癌症的发展情况。
[0005] 但是由于癌症可以在身体的各种器官和组织中存在并发生转移，并没有一种适用 于所有癌症的检测标记可以用于癌症的检测。但是本发明人惊奇的发现，血浆DNA中基因 组重复区的甲基化水平的低表达和癌症的存在是相关的。因此，本发明利用高通量测序技 术，发明了一种测序和分析血浆DNA中基因组重复区低甲基化水平的方法和试剂盒，可实 现癌症在外周血中快速、准确、无创、高灵敏检测，可为患者提供各种诊断治疗依据。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种无创癌症检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007] 从受试者采集外周血并分离血浆；
[0008] 抽提血浆DNA并用亚硫酸氢盐处理；
[0009] 将上述用亚硫酸氢盐处理后的血浆DNA用聚合酶扩增以制备测序文库；
[0010] 对所制备的测序文库进行高通量测序；
[0011] 将高通量测序得到的序列与人类基因组进行对比；统计高通量测序得到的序列 中基因组特定区域甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平进行对 t匕，以判断所述受试者是否患有癌症。
[0012] 优选地，统计高通量测序得到的序列中基因组重复区甲基化水平，并与根据健康 人群确定的基因组单位长度甲基化平均值和标准方差进行对比，统计甲基化水平低于平均 值-ηχ (η倍）标准方差的单位数目以判断所述受试者是否患有癌症，其中η为1-5的整数。
[0013] 优选地，其中基因组单位长度为0.5-5Μ，优选1-3Μ，并且η为3。更优选地，其中所 述基因组重复区为基因组CpG重复区。特别优选地，其中以IM基因组长度为单位统计CpG 重复区内的甲基化比例，针对每个单位窗口统计Z - Score = 圆， 其中，％ MDsample为样品的甲基化程度百分比，mean% 为健康人甲基化程度平均值， 为健康人甲基化程度标准方差。如果Z Score < -3的单位数目的比例大于0 %，优 选大于0.04%，更优选大于0. 1 %，进一步优选大于1 %的受试者判断为癌症阳性。更优选 地，所述高通量测序技术选自 R〇che/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、Applied Biosystems SOLID和life Technologies/Ion Torrent/Proton。更优选地，在用亚硫酸氢盐处理抽提血 浆DNA之前，还包括用对所抽提的血浆DNA进行末端修复和连接甲基化接头的步骤。更优 选地，所述癌症选自胃癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤肝癌、肺癌、肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、 卵巢癌、乳腺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、鼻咽癌、骨癌和肾癌。
[0014] 本发明另一方面，本发明提供一种无创癌症检测试剂盒，其特征在于，包括，血浆 DNA抽取试剂、高通量测序重测序文库构建试剂、亚硫酸氢盐试剂、DNA扩增引物及扩增试 齐U、甲基化序列比对软件、重复区甲基化水平统计软件。优选地，统计高通量测序得到的序 列中基因组特定区域甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平差进 行对比，以判断所述受试者是否患有癌症。更优选地，统计基因组重复区甲基化水平，并与 根据健康人群确定的基因组单位长度甲基化平均值和标准方差进行对比，统计甲基化水平 低于平均值-η倍标准方差的单位数目以判断所述受试者是否患有癌症，其中η为1-5的整 数。更优选地，其中基因组单位长度为〇. 5-5Μ，优选1-3Μ，所述基因组重复区为基因组CpG 重复区并且η为3。更优选地，其中以IM基因组长度为单位统计CpG重复区内的甲基化比 例，针对每个单位窗口统计:Z - Se. = ，其中，% MDsample为样 ?^^γθ? erence κ 品的甲基化程度百分比，mean % MD,为健康人甲基化程度平均值，为健康人甲 基化程度标准方差。如果Z Score <-3的单位数目的比例大于0 %，优选大于0.04%，更 优选大于〇. 1 %，进一步优选大1 %的受试者判断为癌症阳性。更优选地，所述试剂盒还包 括高通量测序试剂。更优选地，所述所述癌症选自胃癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、 肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、鼻因癌、 骨癌和肾癌。更优选地，所述高通量测序技术选自R〇che/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、 Applied Biosystems SOLID 和 life TechnoIogies/Ion Torrent/Proton。
【附图说明】
[0015] 图I示本发明设计思想。本发明的癌症检测方法主要包括外周血采集和血浆分离 步骤；抽提血浆DNA并用亚硫酸氢盐处理以制备测序文库的步骤；高通量测序步骤；和数据 分析步骤，其中包括将测序得到的序列与人类基因组进行对比并统计重复区甲基化水平以 及根据和健康人群的甲基化水平平均值进行对比以判断是否患有癌症。其中在测序文库的 制备过程中还包括先将血浆DNA连接甲基化接头，为文库扩增做准备。其中亚硫酸氢盐处 理，目的是将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，用于测序区分胞嘧啶是否甲基化。
[0016] 图2本发明文库构建效果，图为2%琼脂糖胶。文库大小约290bp，其中接头总长 约 120bp，符合实验预期。M :markerl :WCZ2 :WJJ3 :LJS4 :XGZ5 :SB6 :SHY7 :YQH8 :ZYL
[0017] 图3本发明可有效区分胃癌与健康对照，癌症样品表现出明显的低甲基化水平。 图示为以11个健康人为对照，计算每IMb窗口内CpG区甲基化例平均值MD mean与标准方差 SD，对每份样品每条染色体统计偏离MD_n±3SD的数据点。图A为4份胃癌血浆样品，由外 到内分别为样品WCZ WJJ LJS XGZ，与从健康对照比表现出明显的低甲基化水平。图B为健 康对照样品（样品名SB)示例，无数据点偏离，全部对照如此。
[0018] 发明【具体实施方式】
[0019] 1人外周血全血的采集和血浆的分离
[0020] 血液标本的采集是分析质量控制的重要环节，可采用毛细血管采血法、静脉采血 法、动脉采血法、和真空负压静脉采血法。其中最采用的采血方法是静脉采血法，其采血量 大，可用于各种临床检测。而真空静脉采血法是近年来采用的一种新的采血方法，此法简便 易行。分离血浆可以使用各种常用的方法，例如离心法，血浆分离器，血浆分离杯，血浆分离 机等。
[0021] 2血浆DNA抽提
[0022] 血浆DNA抽提方式主要有两种，磁珠法与分离柱法。原理基本一致，血浆DNA以DNA 与核小体缠绕的方式存在，首先需要在蛋白酶作用下将核小体消化，使DNA游离出来。然后 缓冲液作用下结合到磁珠表面或柱膜上，清洗杂质后将DNA洗脱下来。磁珠法相对纯度较 高，操作所需设备要求低，便于大规模应用。
[0023] 3测序文库制备
[0024] 血浆DNA末端可能出现平末端、3'突出、突出和有无磷酸集团情形的不同组合。 利T4DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T4PNK组合进行末端修复将其修整成平末端且5'端 带有磷酸。亚硫酸氢盐处理DNA可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，故连接的高通量 测序接头需经甲基化修饰，以避免后续亚硫酸氢盐甲基化的影响。亚硫酸氢盐主要是亚硫 酸氢钠，是目前普遍采用的甲基化转化试剂。经亚硫酸氢盐处理后，DNA链中出现尿嘧啶， 不同聚合酶对尿啼陡识别差异较大，需采用对尿啼陡不敏感的聚合酶，例如pfu Turbo Cx HotStart DNA Polymerase (Agilent,美国）。
[0025] 4高通量测序