一种辅酶再生与树脂原位萃取促进Colletotrichum lini ST-1对DHEA的羟化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用辅酶再生与树脂原位萃取“二合一”的策略，提高亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini) ST-1转化去氢表雄酮(DHEA)为7 α, 15 α-羟基-去氢表雄酮(7 α，15 a -d1H-DHEA)转化率的方法。
【背景技术】
[0002]去氢表雄酮(dehydroepiandrosterone, DHEA)是一种C19肾上腺留类化合物，主要具有抗癌、延缓衰老及免疫调节等作用。其作为留体药物前体，在治疗绝经期综合症、硬皮病、冠心病、痛风、艾滋病等方面已作了广泛的研究并取得了一定的进展。近些年来，国内外研究者对去氢表雄酮的生物转化作用进行了广泛深入的研究。研究表明Colletotrichum lin1.、Mucorracemosus、Fusarium菌株倉泛将 DHEA 进——步羟化为 7 a -OH-DHEA 和 7 α，15 a -d1H-DHEA。其中，羟化产物 7 α，15 a -d1H-DHEA，是一种重要的留体药物中间体，可用于合成多种留体激素类药物，如合成“第四代” 口服避孕药的主成分屈罗酮。由于7 α，15 a -d1H-DHEA具有重要药理作用和药用价值，其市场前景相当可观，因此如何提高DHEA的双羟化产率成为当前留体药物领域研究的一大热点。
[0003]目前，能将DHEA —步转化为 7 α，15 a -d1H-DHEA 的菌株中以 Colletotrichum7i/?i活性最高，其在底物投料浓度为10 g/L的条件下，产物的摩尔转化率能达到30%左右。DHEA的生物转化具有留体生物转化本质问题，如菌株转化活性不高、底物投料浓度低和生物相容性差、P450酶表达量不高等。针对这一现状，近些年来国内外大部分的研究都集中在筛选新型菌株或改造已有菌株，建立新型转化体系以及改善P450的表达量或提高P450的活性。这些研究都在一定程度上对DHEA的转化有正影响，但对DHEA转化为7 a, 15 a -d1H-DHEA的转化率提高幅度不大。鉴于留体生物转化的机制是底物在P450酶、NADPH-P450还原酶和02的参与下，在底物分子中加入一个O原子形成羟基，因此推测转化过程中提供还原动力的NADPH的再生也是不可忽略的一部分。同时，为了提高底物投料浓度，如何有效抑制产物的进一步降解也是亟待解决的难题。本专利为解决辅酶的循环再生以及底物投料浓度问题，建立了一种辅酶再生与树脂原位萃取“二合一”的策略，显著的提高了底物投料浓度和DHEA的转化率，为7 α，15 a -d1H-DHEA的工业化奠定了基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种辅酶再生与树脂原位萃取“二合一”的方法，通过添加适量的辅底物进行NADPH再生，同时加入适量大孔吸附树脂抑制产物降解，最终实现DHEA转化过程中高底物投料浓度、高产物得率的要求。
[0005]应用上述方法转化DHEA生产7 α，15 a -d1H-DHEA的方法，其步骤如下:
(I)采用保藏号为CGMCC N0.6501的亚麻刺盘孢霉(lini) ST-1为生产菌种，25-40°C，120-220 r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到PDA平板上；
(2)制备C.lini ST-1菌株的细胞液体培养物:挑取步骤(I)的PDA固体培养基上的
C.7i/?i菌株一环，接种于已灭菌的装有20-50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为25-40°C，置摇床上以120-220 r/min的转速培养12-16 h至对数生长中期，即得到C.lini ST-1菌株的细胞液体培养物；
(3)发酵培养:将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以8-10%(v/v)的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20-50 mL发酵培养基，培养温度为25_40°C，在120-220 r/min的转速下培养20-24 h，得发酵液。
[0006](4)辅酶再生:将步骤(3)中培养好的发酵液加入20 mM烟酸和10_15 g/L的糖(葡萄糖、果糖或蔗糖)为辅底物，通过烟酸和糖类物质的代谢进行NADPH再生。
[0007](5)生物转化:称取适量粉末状底物DHEA，投入步骤(3)中培养好的发酵液，使其终浓度为10-15 g/L，在转化温度28°C，200-220 r/min的转速下转化24-36 h，即得初转化液。
[0008](6)树脂原位萃取:待步骤(5)中的转化液转化24-36 h时，投入适量的DlOl型大孔吸附树脂吸附转化产物7 α，15 a -d1H-DHEA,继续转化24_36 h，即得终转化液。
[0009](7)产物检测:将步骤(6)的转化液在8000-12000 r/min下离心5-10 min，上清用等体积乙酸乙酯抽提3次，沉淀用适量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22 μ m的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析 DHEA 和 7 α，15 a -d1H-DHEA 的含量。
[0010]其中步骤(I)中所述的PDA培养基的成分及配比为:土豆200-500 g/L ;葡萄糖20-50 g/L ;酵母粉2-10 g/L ;琼脂粉10-20 g/L ；pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min ；步骤(2)所述种子培养基的成分及配比为:花生饼粉5-15 g/L，葡萄糖20-50 g/L ；KC10.1-1 g/L ;酵母粉 10-30g/L ；K2HPO4 0.1-1.0 g/L ；MgS047H20 0.01-0.1 g/L ；FeS047 H2O
0.01-0.1 g/L g/L ;灭菌前调培养基的pH至6.5-7.5，在121°C高压蒸汽下灭菌20min ;步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为:葡萄糖10-100 g/L ;酵母粉5-50g/L ;蛋白胨5-50 g/L ；NaCl 0.2-2 g/L ；Κ2ΗΡ04 0.1-1.0 g/L ；KH2PO4 0.1-1.0 g/L ；MgS04 0.01-0.1 g/L ；FeS047 H2O 0.01-0.10 g/L ；pH 6.5-7.5，121 °C高压蒸汽下灭菌 20 min。
[0011]本发明所述的利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum 7i/?i)ST-l轻化去氢表雄酮的方法，是首次利用辅酶再生与树脂原位萃取“ 二合一 ”相结合的转化策略，最终实现了高底物投料浓度下高产物得率的目的，此方法对微生物羟化留体化合物合成留体药物中间体具有重要的借鉴意义。
【附图说明】
[0012]图1为辅底物再生NADPH的示意图。
[0013]图2为本发明的在辅酶再生与树脂原位萃取“二合一”策略下亚麻刺盘孢霉ST-1转化DHEA的过程研究。
【具体实施方式】
[0014]实施例1大孔吸附树脂型号的确定将适量的底物或产物加入30 ml/250 mL水溶液中，于220 rpm摇床上平衡2 h至溶液饱和，静置分离上清。然后在底物和产物上清中分别加入I g不同型号树脂，包括H103、D101、AB8、HP20、HZ801以及DA201 (根据底物和产物极性选择)，再将其置于220 rpm摇床上平衡2 h，至树脂达吸附平衡。吸附后的树脂用乙酸乙酯萃取，通过液相分析后计算树脂对底物和产物的吸附量，最终选择对产物亲和性高而对底物亲和性低的树脂进行后续转化实验。
[0015]实施例2辅酶再生与树脂原位萃取“二合一”策略促进C.lini ST-1对DHEA的羟化
(I)制备C.lini ST-1菌株的细胞液体培养物
挑取固体PDA培养基上的亚麻刺盘孢霉菌株一环，接种在装有30 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以200 r/min的转速培养20-24 h至对数期，即制得C.lini ST-1的细胞液体培养物。
[0016](3)发酵培养基的成分及配比为:葡萄糖20-50 g/L ;酵母粉10_30g/L ;蛋白胨5-20 g/L ;玉米浆 3-10 g/L ；NaCl 0.2-2 g/L ；K2HPO4 0.1-1.0 g/L ；MgS04 0.1-1 g/L ；FeS047 H2O 0.01-0.10 g/L ；pH 6.5-7.5，121 °C高压蒸汽下灭菌 20 min。
[0017](4)摇瓶发酵:将上述C.lini ST-1菌株的细胞液体培养物以8_10% (w/w)的接种量接种在装有已灭菌的装有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在20-40°C条件下，置于摇床上以120-200 r/min的转速培养，发酵20-24 h，菌体进入对数生长期。
[0018](5)辅酶再生:将步骤(3)中培养好的发酵液加入20 mM烟酸和10-15 g/L的糖(葡萄糖、果糖或蔗糖)为辅底物，通过辅底物的代谢进行NADPH再生。
[0019](6)生物转化:加入辅底物的同时，称取适量粉末状底物DHEA，投入步骤(3)中培养好的发酵液，使其终浓度为10-15 g/L，在转化温度28°C，200-220 r/min的转速下转化24 h，即得初转化液。
[0020](7)树脂原位萃取:待步骤(6)中的转化液转化24-36 h时，投入适量的DlOl型大孔吸附树脂，用以吸附转化生成的产物7 α，15 a -d1H-DHEA,继续转化24_36 h，即得终转化液。
【主权项】
1.一种利用辅酶再生与树脂原位萃取“二合一”的策略促进亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini) ST-1对去氢表雄酮的轻化,其特征在于:将C.7i/?i于发酵培养基中培养24 h后，加入20 mM烟酸和10-15 g/L的糖为辅底物，同时加入10-15 g/L底物DHEA，在转化温度28°C，200-220 r/min的转速下转化24-36 h，然后再投入适量的DlOl型大孔吸附树脂，继续转化24-36 h。
2.如权利要求1所述的亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum7i/?i)ST_l轻化DHEA的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的选择如下:将适量的底物或产物加入30 ml/250 mL水溶液中，于220 rpm摇床上平衡2 h至溶液饱和，静置分离上清；然后在底物和产物上清中分别加入I 8不同型号树脂，包括11103、0101、488、册20、!12801以及DA201，再将其置于220rpm摇床上平衡2 h，至树脂达吸附平衡；吸附后的树脂用乙酸乙酯萃取，通过液相分析后计算树脂对底物和产物的吸附量，最终选择对产物亲和性高而对底物亲和性低的树脂进行后续转化实验。
【专利摘要】本发明属生物技术领域，涉及一种利用辅酶再生与树脂原位萃取“二合一”的策略促进亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1对去氢表雄酮（DHEA）的羟化。其特征在于，转化过程中加入10 g/L的辅底物进行NADPH再生，同时利用D101型大孔吸附树脂原位萃取产物，从而显著提高C. lini ST-1对DHEA的转化率。在底物投料量为10 g/L的条件下，底物DHEA的转化率为93%，7α,15α-diOH-DHEA的产量可达到为7.12 g/L。
【IPC分类】C12P33-06, C12R1-645
【公开号】CN104611400
【申请号】CN201410684414
【发明人】许正宏, 吴燕, 李会, 李恒, 史劲松, 张峥斌, 张汝金
【申请人】江南大学, 浙江仙居君业药业有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年11月25日