一种生产谷胱甘肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种改进的生产谷胱甘肽的方 法。
【背景技术】
[0002] 谷胱甘肽（Glutathione，GSH)是一种重要的调节生理功能的药物，在临床上的应 用越来越广，已成为医学重要的具有调节人体免疫功能和辅助抗癌的药物之一。GSH的抗氧 化性又使它在食品工业中的应用备受人们关注，在食品贮藏保鲜和改善产品风味、提高产 品营养价值方面的作用越来越被看好。谷胱甘肽是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸缩合 而成的一种含Y 2谷氨酰基和巯基的生物活性三肽类化合物，在蛋白质和DNA的合成、氨基 酸的转运、细胞的保护等重要的生物学现象中起着直接或间接作用。它主要分布于动物、植 物、微生物细胞中，被广泛应用于临床医学、运动保健、食品加工等很多领域。因此，GSH已 成为各国科学家研究和探索的热点。目前国内外生产谷胱甘肽的方法主要有萃取法、化学 合成法、发酵法、酶法。由于发酵法生产GSH具有菌种易于培养、原料来源方便廉价、反应步 骤简单、成本低、转化效率高、生产速率快等优点，已成为当前生产谷胱甘肽的主要方法。
[0003] 目前现有技术中已经存在一系列生产GSH的菌株，通常能在很广的培养条件下生 长并积累GSH，但产量普遍很低。目前还有很多理论和技术上亟待攻克的课题，如高产菌株 的选育及培养条件的优化等。因此，本领域亟需进一步研究生物合成或生物结合化学法生 产谷胱甘肽的新方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种改进的生产谷胱甘肽的方法。
[0005] 在本发明的第一方面，提供一种生产谷胱甘肽的方法，所述方法包括：
[0006] (1)在大肠杆菌细胞中过表达（外源的）谷胱甘肽双功能酶（STH)以及乙酸激酶 (ack)，获得重组表达细胞；和
[0007] (2)破碎（1)的细胞，将细胞破碎产物与L-半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸或其盐 (如钠盐）、无机盐和ATP混合反应，生产谷胱甘肽。
[0008] 在一个优选例中，步骤（1)中，还在大肠杆菌细胞中过表达（外源的）谷胱甘肽合 成酶。
[0009] 在另一优选例中，步骤（1)中，所述的谷胱甘肽双功能酶编码基因和乙酸激酶编 码基因和/或谷胱甘肽合成酶编码基因 gshB表达于同一大肠杆菌细胞培养系统中；或表达 于不同的大肠杆菌培养系统中。
[0010] 在另一优选例中，步骤⑴包括：
[0011] (a)提供一种重组大肠杆菌细胞，所述重组大肠杆菌细胞中包含以下基因的重组 表达盒：谷胱甘肽双功能酶编码基因和乙酸激酶编码基因，以及选择性含有谷胱甘肽合成 酶编码基因 gshB ;或
[0012] 提供重组大肠杆菌细胞，包括：一种包含谷胱甘肽双功能酶编码基因的重组表达 盒的大肠杆菌细胞和一种包含乙酸激酶编码基因的重组表达盒的大肠杆菌细胞和/或一 种包含谷胱甘肽合成酶编码基因 gshB的重组表达盒的大肠杆菌细胞；和
[0013] (b)培养（a)的重组大肠杆菌细胞，从而过表达谷胱甘肽双功能酶以及乙酸激酶。
[0014] 在另一优选例中，所述的大肠杆菌是Rosetta(DE3)。
[0015] 在另一优选例中，所述的谷胱甘肽双功能酶是来源于嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)的谷胱甘肽双功能酶（较佳地，其基因序列如NCBI登录号：⑶138096. 1，或 其按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化后的序列）；
[0016] 所述的乙酸激酶是来源于旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis)(较 佳地，其基因序列如NCBI登录号：AB035799. 1，或其按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码 子优化后的序列）；或来源于大肠杆菌（Escherichia coli)(较佳地，其基因序列如NCBI登 录号：CP001509,或其按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化后的序列）的乙酸激酶。
[0017] 在另一优选例中，步骤（2)中，所述的无机盐包括：镁盐，乙酰磷酸盐。
[0018] 在另一优选例中，步骤⑵中，反应体系包括：L-半胱氨酸：80±40mM ;甘氨 酸：120±40mM ;L-谷氨酸钠：120±40mM ;七水氯化镁：40±30mM ;乙酰磷酸二锂盐： 120±40mM ;ATP :1±0. 5mM ;细胞破碎产物：10 ?30%V/V。
[0019] 在另一优选例中，所述的细胞破碎产物指：步骤（1)的重组表达细胞产物离心后， 用4倍体积磷酸缓冲液重悬后的破碎产物。
[0020] 在另一优选例中，反应的温度为30 ±5 °C ;较佳地30 ±2 °C。
[0021] 在另一优选例中，反应的pH为7. 0±0. 5 ;较佳地7. 0±0. 2。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种重组表达载体所述的重组表达载体包括以下基因 的重组表达盒：谷胱甘肽双功能酶编码基因和乙酸激酶编码基因和/或谷胱甘肽合成酶编 码基因 gshB。
[0023] 在本发明的另一方面，提供一种重组的大肠杆菌细胞，所述的大肠杆菌细胞包括 所述的表达载体，或
[0024] 所述的大肠杆菌细胞的基因组中整合以下基因的重组表达盒：谷胱甘肽双功能 酶（STH)编码基因和乙酸激酶（ack)编码基因，以及选择性含有谷胱甘肽合成酶编码基因 gshB ;较佳地，所述的大肠杆菌是Rosetta (DE3)。
[0025] 在本发明的另一方面，提供所述的重组表达载体或所述的重组大肠杆菌细胞的用 途，用于转化L-半胱氨酸、L-谷氨酸和甘氨酸为谷胱甘肽。
[0026] 在本发明的另一方面，提供一种用于生产谷胱甘肽的试剂盒，所述试剂盒中包括： 所述的重组表达载体或所述的重组的大肠杆菌细胞。
[0027] 在一个优选例中，所述的用于生产谷胱甘肽的试剂盒，所述试剂盒中还包括： L-半胱氨酸、甘氨酸、L-谷氨酸或其盐（如钠盐）、无机盐和ATP ;较佳地，所述的无机盐包 括：七水氯化镁，乙酰磷酸二锂盐。
[0028] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0029] 图1、重组质粒pET24a_SAG的质粒图谱。
[0030] 图2、重组质粒pET24a_STH的质粒图谱。
[0031] 图3、重组质粒pET28b_gshA的质粒图谱。
[0032] 图4、重组质粒pET24a_gshB的质粒图谱。
[0033] 图5、重组质粒pTrc99a_STH的质粒图谱。
[0034] 图6、重组质粒pSUGAP的质粒图谱。
[0035] 图7、重组质粒pSUGAP-STH的质粒图谱。
[0036] 图8、重组质粒pET32amal的质粒图谱。
[0037] 图9、重组质粒pET32amal_STH的质粒图谱。
[0038] 图10、重组质粒pET24a_ack的质粒图谱。
[0039] 图11、重组质粒pET24a_ECack的质粒图谱。
[0040] 图12、重组质粒pMWK的质粒图谱。
[0041] 图13、重组质粒pET24a_gshB_ack的质粒图谱。
[0042] 图14、重组质粒pMWK-gshB-ack的质粒图谱。
[0043] 图15、重组质粒pTrc99a-gshB-ack_773的质粒图谱。
[0044] 图16、重组质粒pTrc99a-ECack_773的质粒图谱。
[0045] 图 17、BL21 (DE3)/pET24a-SAG 和 BL21 (DE3)/pET24a-STH 的蛋白电泳。其中， 1-3 :BL21(DE3)/pET24a-SAG 的全细胞，上清和沉淀；10-12 :BL21(DE3)/pET24a-STH 的全细 胞，上清和沉淀；4-6 :Rosetta(DE3)/pTrc99a-STH/pMWK-gshB_ack 的全细胞，上清和沉淀； 7-9 :Rosetta(DE3)/pTrc99a-STH的全细胞，上清和沉淀；M是蛋白质分子量标准（KDa)。
[0046] 图 18、BL21 (DE3)/pET24a-gshA 和 BL21 (DE3)/pET24a-gshB 的蛋白电泳。
[0047] I :BL21 (DE3) /pET28b-gshA 的沉淀；
[0048] 2 :BL21 (DE3) /pET28b-gshA 的上清；
[0049] 3 :BL21 (DE3) /pET24a_gshB 的沉淀；
[0050] 4 :BL21 (DE3) /pETMa-gshB 的上清。
【具体实施方式】
[0051] 为了提高谷胱甘肽（Glutathione，GSH)产量，本发明人经过深入的研究，通过筛 选重组表达宿主以及选择合适的酶进行过表达，获得了可高效转化L-半胱氨酸、L-谷氨酸 和甘氨酸为谷胱甘肽的重组菌株，应用所述菌株可有效地提高了 GSH的产量。本发明的方 法可提高谷胱甘肽产量50%以上。
[0052] 如本文所用，如本文所用，所述的"表达盒"是指包含有表达目的多肽（本发明中 为谷胱甘肽双功能酶（STH)、乙酸激酶（ack)和/或谷胱甘肽合成酶gshB)所需的所有必要 元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外 还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
[0053] 因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物包括：STH、ack以及选择性地包括 gshB的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有元件（包括启动子、编码DNA以及 终止子等），从而可完整地表达出相应的蛋白。
[0054] 通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述 的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟 知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成 技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导