一种谷胱甘肽荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种检测细胞中谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术：

氨基酸是构成蛋白质的基本物质，并且与生物的生命活动有着密切的联系。半胱氨酸(cysteine，cys)、同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)和谷胱甘肽(glutataione，gsh)是生物体内常见的巯基化合物，在维持生物的正常生理活动中起着重要的作用。医学研究表明不正常的生理浓度可能引起很多疾病，比如肾功能衰竭、老年痴呆症、帕金森疾病、心血管疾病、冠心病、肌肉损伤、皮肤松弛等，它们在生物体内含量变化可以作为这些疾病诊断的依据。因此，在生理条件下高选择性、高灵敏性地检测小分子生物硫醇是非常重要的，当前已引起广泛的关注及深入研究。

目前已经应用的技术包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学检测、光学分析和质谱鉴定，这些方法仅可以在体外监测半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽。荧光分子探针不仅灵敏度高选择性好，而且能够在活细胞中检测分析物，所以研究者们开始关注将荧光分子探针的这项技术应用于对体外和活细胞内的半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽进行监测或者细胞荧光成像。目前已经报导了多种基于化学反应的该类荧光探针，例如michael加成和亲核取代反应等。在这些方法中，利用michael加成使荧光恢复是一种特别有效的方法。由于这三种氨基酸都含有巯基(-sh)并且在结构和反应活性上相差较小，所以这类荧光探针很难将谷胱甘肽和半胱氨酸/同型半胱氨酸区分开，因此研发能够识别谷胱甘肽的荧光探针是很有必要的。

技术实现要素：

针对现有探针对半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽区分度不够的问题，本发明提供一种反应灵敏、检测限低、特异性好的可检测细胞谷胱甘肽的荧光探针co-gsh，可用于评价和研究细胞内谷胱甘肽的生理功能。

本发明的另一目的是提供一种简便地合成上述谷胱甘肽的荧光探针co-gsh的方法。

本发明还提供了一种上述荧光探针对溶液和细胞内细胞器微环境中的粘度进行传感检测的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种谷胱甘肽荧光探针co-gsh，具有如式(i)所示的结构：

一种上述荧光探针co-gsh的制备方法，采用以下步骤：

(1)将4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯加入乙醇、哌啶，加热回流，除溶剂后，得化合物7-二乙胺基香豆素-3-甲酸乙酯；

(2)将浓盐酸、冰乙酸加入7-二乙胺基香豆素-3-甲酸乙酯中回流，冷却后将反应液倒入冰水中，减压过滤得7-二乙胺基香豆素；

(3)将三氯氧磷加入到二甲基甲酰胺(dmf)中搅拌，然后加入7-二乙胺基香豆素加热反应，反应液冷却后倒入冰水中，调ph，减压过滤得7-二乙胺基香豆素-3-甲醛；

(4)7-二乙胺基香豆素-3-甲醛与4-硝基苯乙酮在乙醇中加热回流，生成(e)-7-二乙胺基-3-(3-(4-硝基苯基)-3-桥氧基)香豆素，简称co-gsh。

合成路线如下：

所述制备方法中，4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯的摩尔比为1:1.2-1.8；浓盐酸、冰乙酸与7-二乙胺基香豆素-3-甲酸乙酯的摩尔比为10-15:10-15:1；三氯氧磷、dmf与7-二乙胺基香豆素的摩尔比为1:1:1.5-1.8；7-二乙胺基香豆素-3-甲醛与4-硝基苯乙酮的摩尔比为1:1.1-1.5。

所述制备方法中，步骤(1)的反应温度为80℃；步骤(2)的反应温度为105℃，反应时间为10-16h；步骤(3)的反应温度为60℃，ph为6.8-7.5；步骤(4)的反应温度为80℃。

所述制备方法中，步骤(2)与步骤(3)的冰水体积为反应液的1-2倍。

一种上述荧光探针用于溶液和细胞中gsh含量检测的应用。

上述应用，荧光探针co-gsh应用于溶液时的激发波长为430nm，发射波长为480nm和600nm应用于细胞时的激发波长为488nm，发射波段为500-550nm和625-675nm；荧光检测的时间为反应40min后。

本发明所述检测gsh的荧光探针co-gsh本身由于7-二乙胺基与羰基之间组成强推拉电子体系使探针的荧光发射在600nm左右，当探针与gsh分子作用后，化合物co-gsh的与gsh发生michael加成反应，导致探针共轭体系变短，使得荧光蓝移。识别机理如下：

gsh基团结构为：

本发明具有以下优点：

本发明的co-gsh荧光探针是一种简单，快速，灵敏的gsh特异性检测试剂；在低浓度下即可特异与gsh反应，抗多种活性氧、氨基酸及含巯基化合物的干扰；在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为co-gsh的¹hnmr谱图；

图2为co-gsh荧光探针对不同分子或离子的选择性；

图3为不同浓度的gsh下co-gsh的荧光强度与波长；

图4为co-gsh的荧光波长随gsh作用时间的变化；

图5为co-gsh荧光探针对细胞内源性gsh荧光图像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1co-gsh荧光探针的合成：

(1)在100ml圆底烧瓶中，加入4-二乙胺基水杨醛0.01mol，丙二酸二乙酯0.015mol，再加入乙醇20ml、哌啶250μl，80℃加热回流，减压蒸除溶剂，得7-二乙胺基香豆素-3-甲酸乙酯；

(2)将7-二乙胺基香豆素-3-甲酸乙酯(0.012mol)中加入10ml浓盐酸、10ml冰乙酸105℃回流12h，反应结束冷至室温后，将反应液倒入冰水中，析出大量固体，减压过滤得到7-二乙胺基香豆素，产率81.9％；

(3)氮气保护下将2ml三氯氧磷加入到2mldmf中，在室温下搅拌30min，然后将7-二乙胺基香豆素(0.01mol)加入，在60℃下反应6h，反应结束后将反应液于冰水中，调ph至7左右，析出固体，减压过滤得到7-二乙胺基香豆素-3-甲醛，产率67％；

(4)将7-二乙胺基香豆素-3-甲醛(0.011mol)与4-硝基苯乙酮(0.013mol)加入到20ml乙醇中，80℃回流12h，冷却至室温，减压过滤得到红色固体，即(e)-7-二乙胺基-3-(3-(4-硝基苯基)-3-桥氧基)香豆素，简称co-gsh，产率77％；co-gsh的¹hnmr谱图如图1所示：¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.52(s,1h),8.38(t,j＝14.2hz,2h),8.33–8.17(m,2h),8.02(d,j＝15.4hz,1h),7.72(d,j＝15.4hz,1h),7.49(t,j＝15.3hz,1h),6.82(dd,j＝9.0,2.4hz,1h),6.64(t,j＝7.0hz,1h),3.59–3.44(m,6h),1.11(dd,j＝26.3,14.0,7.0hz,4h)。

实施例2co-gsh荧光探针对不同分子或离子的选择性

将实施例1中co-gsh荧光探针配制成浓度为1mm的母液。

将下列物质br^-,clo^-,cu²⁺,f^-,fe²⁺,h2o2,hclo,hg²⁺,hpo4^2-,mg²⁺,n^3-,na⁺,na2s,nahs,no^2-,no^3-,oac^-,onoo^-,s2o3^2-,scn^-,so4^2-,zn²⁺,单线态氧,羟基自由基,gsh,hcy,cys以磷酸缓冲液(0.01mm，ph＝7.4)配制成5ml浓度为40mm的母液。

取28支试管，分别加入25μl探针母液、225μldmso和各离子或分子的母液，对照以等量水代替干扰物质；用磷酸缓冲液(0.01mm，ph＝7.4)定容至5ml，使各离子或氨基酸的终浓度为3mm，活性氧和活性氮的终浓度为100mm。各溶液摇匀后进行荧光检测(λex＝430nm,λem＝600nm)；40min后再次检测(λex＝430nm,λem＝480nm)。以480nm荧光强度与600nm荧光强度的比值为纵坐标，以不同分子或离子为横坐标作图2；其中，1-28分别为co-gsh,br^-,clo^-,cu²⁺,f^-,fe²⁺,h2o2,hclo,hg²⁺,hpo4^2-,mg²⁺,n^3-,na⁺,na2s,nahs,no^2-,no^3-,oac^-,onoo^-,s2o3^2-,scn^-,so4^2-,zn²⁺,单线态氧,羟基自由基,gsh,hcy,cys。由图2可以发现，其他离子或分子的加入对i480/i600比值几乎没有影响，而gsh的加入使i480/i600比值升高，即gsh的加入使co-gsh的荧光发生蓝移。

实施例3不同浓度的gsh下co-gsh的荧光强度与波长变化

配制10ml浓度为100mmgsh的母液，并用水稀释为1-9mm共17个等差浓度，以水为对照。将实施例2中co-gsh母液稀释为5μm，分别加入不同浓度的gsh，反应40min后进行荧光检测(λex＝430nm,λem＝600-480nm)，检测各体系中荧光强度，以荧光强度-gsh浓度作曲线，如图3所示。由图可知，当gsh浓度为最低的试验浓度(1mm)下，co-gsh即有荧光响应；随着gsh浓度的增加，反应体系不但荧光强度增强，发射波长也发生蓝移，当gsh浓度达到9mm时，反应体系荧光强度在480nm达到饱和状态。

实施例4co-gsh的荧光波长随gsh作用时间的变化

以实施例1中co-gsh母液配制5μm探针溶液，以实施例2中gsh母液配制0.3mm溶液。两者混合后进行荧光检测(λex＝430nm,λem＝600nm，λem＝480nm)，以加入等量水的co-gsh溶液为对照，每2min测定一次，测定60min，测定各体系中随时间变化的荧光强度，以480nm荧光强度与600nm荧光强度的比值为纵坐标，以作用时间为横坐标作图4。反应40min后，反应体系荧光强度i480/i600比值变化趋于平缓，接近饱和状态。

实施例5co-gsh荧光探针对内源性gsh细胞成像

将本发明荧光探针co-gsh应用于hela细胞中进行荧光成像，得图5，具体操作步骤如下：

(1)将两份密度为3×10⁵个/ml的hela细胞在温度为37℃，co2浓度为5％的培养箱中培养至细胞贴壁；

(2)取一份细胞，加n-乙基马来酰亚胺(nem)孵育30min后，再加5μmco-gsh孵育40min，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，制样后在荧光显微镜下明场成像得图a)，红通道(625-675nm)成像得图b)，绿通道(500-550nm)成像图c)，明场、红、绿通道叠加得图d)；

(3)取另一份细胞，加5μmco-gsh孵育40min后，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，制样后在荧光显微镜下明场成像得图e)，红通道成像得图f)，绿通道成像图g)，明场、红、绿通道叠加得图h)。

由于nem与巯基残基反应，使gsh巯基烷基化，不能与荧光探针co-gsh反应，由图5可知，表现在荧光成像图像中，添加nem的叠加图像为橘红色，而未添加nem的叠加图像为浅绿色；这说明，荧光探针co-gsh可以与细胞内源gsh反应，并使co-gsh发射波长发生明显的蓝移。