运用比较基因组学快速鉴定草莓白粉病基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是借助于草莓测序全基因组序列，利用植物比较基因组学、遗传学、生物信 息学和候选基因策略等方法快速鉴定草莓白粉病基因，主要涉及到草莓全基因组序列的下 载，候选基因的鉴定，基因的比对，聚类等手段，进而鉴定出白粉病基因，属于植物生物技术 科学领域。
【背景技术】
[0002] 草莓白粉病是草莓生产中主要的病害之一，此病由真菌子囊菌亚门的羽衣草单囊 壳菌（Sphaerotheca aphanis)侵染所致，病原菌为专性寄生菌，主要通过带菌的草莓苗等 繁殖体进行中远距离传播；花期染病可导致花瓣变红，花蕾不开花，果实染病后，幼果不能 正常膨大，果面覆有粉状物，严重影响了草莓的品质。草莓白粉病一旦大面积发生，极难根 除，草莓本身为鲜食浆果，频繁使用农药势必会影响到食用的安全。因此，选育抗白粉病又 有优良的色、香、味、形等商品经济性状的品种，已成为草莓育种的重要方向。
[0003] 目前不同的草莓品种对白粉病抗性存在较大差异，利用传统的育种方法，工作繁 琐、育种周期长且选择效率低，不利于快速的选育适合草莓抗病品种。所以人们通常运用现 代的基因克隆技术，将外源的抗病基因导入性状优良的草莓品种，从而获得高抗优质的草 莓新品种。因此克隆草莓抗白粉病基因并研究其结构及功能特点，对抗病基因的利用具有 重要的意义。
[0004] MLO型抗病基因是植物特异的一类抗病基因。研究者最早发现ML0(Mildew resistance locust)基因对白粉病抗性是始于1937-1938年，由德国人在埃塞俄比亚采集 了很多品种的大麦，其中的两个株系对白粉病菌（Blumeriagraminisf.sp.hordei)所有已 知的生理小种都具有高效抗性。进一步研究表明，大麦中MLO基因的隐性突变mlo可以使大 麦对几乎所有已知大麦白粉病菌的生理小种产生持久、广谱的抗性。最近，研究者发现很多 植物的抗白粉病基因都是MLO型基因控制，如番茄，豌豆、拟南芥、蔷薇、辣椒、百脉根等等。 因此挖掘植物中的MLO型抗病基因对植物抗白粉病育种具有重要的作用。
[0005] 目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有图位克隆，转座子标签等方法。但是由于草 莓的基础研究不够深入，因此利用这些方法不仅时间长而且很难准确地克隆这些基因。因 此，如何快速鉴定草莓中的MLO型抗病基因将成为草莓抗白粉病育种的重要前提。
[0006] 植物比较基因组学（Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对 已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利 用模式植物基因组与其它植物基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆其他植物基 因，揭示基因功能和分子机制，阐明物种进化关系及基因组的内在结构。本专利所采用的方 法及思路：模式植物拟南芥基因组研究已经揭示了 MLO型基因的功能，利用基因其顺序上 的同源性克隆草莓MLO型抗病基因，根据模式植物拟南芥实验系统上的优越性和已知MLO 型抗病基因的特点，快速"捕捉"草莓抗白粉病基因。本专利介绍了以草莓全基因组序列为 前提，结合比较基因组学、遗传学、基因组学、生物信息学和候选基因策略等知识，快速挖掘 白粉病基因。
【发明内容】
[0007] 技术问题
[0008] 本发明的目的是提供一种通过结合植物比较基因组学、植物遗传学、基因组学和 生物信息学等知识，快速挖掘草莓抗白粉病基因。其结果一方面可用于草莓白粉病基因紧 密连锁分子标记的开发，进行分子标记辅助选择育种，另一方面也为其他作物白粉病基因 鉴定提供参考依据。
[0009] 技术方案
[0010] 主要原理：第一个植物抗白粉病基因（MLO)是从大麦中克隆的，研究发现此基因 是一类特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多数NBS(nucleotide-binding site)类型抗 病基因；随后，研究者相继从番茄、拟南芥、豌豆、辣椒、百脉根等植物中克隆了白粉病基因， 研究发现这些基因编码的都是MLO型抗病基因。随后，众多研究者通过多次试验证实MLO 型抗病基因已经成为植物特有的一类抗白粉病基因。进一步发现，植物MLO类型基因是一 个基因家族；而且对来源于不同物种的MLO基因家族进行系统发育关系分析发现，不同物 种中抗白粉病基因总是聚类一起，成为一类，这一类MLO基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。草莓基因组测序的完成为挖掘白粉病基因提供了一条便利途径。因此，可以借 助于已经测序的草莓全基因组中MLO基因家族和已经克隆的MLO白粉病基因的系统发育关 系以及对于维持白粉病基因 MLO重要功能的氨基酸保守性来鉴定草莓白粉病基因。
[0011] 主要步骤如下：
[0012] 1)草莓全基因组序列的下载及其MLO型基因的采集
[0013] 首先从草莓测序基因组数据库（http ://www. strawberrygenome. org/)下载草莓 全基因组序列；使用"DNAT00LS"软件对获得的草莓全基因组氨基酸序列数据建立数据库， 然后用 Pfam 数据库（蛋白家族数据库，http :// pfam. janelia. org/search/sequence)中 的隐马尔可夫模型（HMM)对MLO结构域的氨基酸序列与已建立的草莓全基因组氨基酸序列 数据库进行Blastp (E-Value=O. 001)序列比对，初步筛选出候选基因序列。其次，利用已经 公布的MLO型基因序列，对草莓基因组数据库进行BLAST比对，获得候选基因序列。
[0014] 2)草莓MLO型基因家族的鉴定
[0015] 将上述结果中得到的同源核苷酸序列的候选基因，通过Pfam(E-Value=LO)进行 分析，去除无 'ML0'结构域的基因序列（图1)。再将候选抗病基因序列通过MEGA3. 1软件 提供的ClustalW工具（多序列比对程序）进行多序列比对，去除重复序列。
[0016] 3)通过植物MLO型基因的系统发育关系鉴定候选的草莓MLO型白粉病基因
[0017] 由于先前的研究已经证明，双子叶植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系统 发育树同一区组，因此在系统发育关系研究中，我们把拟南芥的MLO型基因家族和一些其 他作物的MLO型抗白粉病基因和草莓MLO型基因一起聚类分析，以获得候选的草莓抗白粉 病基因（图2)。
[0018] 4)草莓白粉病基因与已知的植物MLO白粉病基因的比对
[0019] 利用Bi〇XM2. 6软件将草莓候选的MLO型白粉病基因和拟南芥、番茄、豌豆、大麦的 MLO白粉病基因的氨基酸序列转换成Fasta格式的文件，将这些文件导入Bi〇Edit7. 0软件， 运用此软件中Clustal软件进行多序列比对，揭示候选白粉病基因重要氨基酸残基及区域 的保守性。从而进一步鉴定草莓候选的白粉病基因（图3)。
[0020] 本发明的积极效果：
[0021] 1)缩短了草莓白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鉴定。采用常规方 法（图位克隆、转座子标签等）挖掘抗白粉病基因不仅耗时耗力、效率低，且难以成功。本 发明基于植物比较基因组学、遗传学、生物信息学方法快速挖掘草莓白粉病基因，不仅可以 缩短时间，还可以提高白粉病基因鉴定效率。
[0022] 2)草莓（Fragaia ananassa)属于是对蔷薇科草莓属植物，是全世界广泛种植的 重要水果作物之一。由于草莓遗传基础狭窄，种质资源多样性低，因此通过常规的分子标记 (RAPD、ISSR、SSR、AFLP等）鉴定草莓白粉病基因比较困难。通过鉴定的候选白粉病基因开 发相应的共分离功能性标记（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子标记辅助选 择，进行多抗性育种材料的创制，可以缩短育种年限，提高育种效率。
[0023] 3)为阐述草莓抗白粉病分子机制奠定了基础。草莓抗白粉病基因的鉴定，通过转 基因技术、RNAi、病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技术等研究 抗白粉病的分子机制提供了基因资源，有利于快速阐述草莓抗白粉病的作用机理。
【附图说明】
[0024] 图1草莓MLO基因的鉴定；
[0025] 本图显示的是20个MLO型基因鉴定结果，每一个基因都含有一个'ML0'保守结构 域。
[0026] 图2植物MLO基因家族的系统发育关系分析及其草莓MLO型白粉病基因的鉴定；
[0027] 拟南芥是植物科学研究的模式植物，在构建系统发育树中，拟南芥的15个MLO型 基因（其中3个基因是白粉病基因：AtML002, AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (SlMLO)、大麦白粉病基因 （HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被选择用来和 草莓MLO型基因聚类分析。共鉴定出3个草莓候选的MLO型白粉病基因。图中斜体标记的 基因就是候选草莓白粉病基因。
[0028] 图3草莓MLO型白粉病基因的比对分析；
[0029] 3个草莓白粉病基因与大麦（HvMLO)、番茄（SlMLO)、豌豆（PsMLO)、拟南芥白粉病 基因（AtML002, AtML006和AtML012)进行比对，鉴定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸残基 和区域的保守型。图中TM1-TM7表示草莓MLO型白粉病基因的7个转模区域；黑色圆点表 示白粉菌侵染重要的氨基酸残基；CaMBD表示钙调蛋白结合区；I和II表示对白粉菌侵染 重要的氨基酸区域。
【具体实施方式】
[0030] 抗病基因的鉴定在作物抗病遗传理论研究和抗病品种选育中具有重要的作用。本 方法可以快速鉴定出草莓白粉病基因。具体实施过程如下：
[0031] 1)草莓MLO型基因的采集
[0032] 为了获得草莓全部的MLO型基因家族成员，我们首先以拟南芥的MLO型基因，番 茄、豌豆、蔷薇、辣椒、百脉根的抗白粉病MLO基因序列构建HMM模型，从草莓基因组序列中 收索MLO型基因；其次以不同作物中已经发表的MLO基因序列作为靶序列（来自DFCI数 据库：TC171015, TC267529, DFCI :TC327983, TC289653, TC312087, TC132500, TC133436， TC317623, TC317025, TC315947, TC325903, TC315944, TC315912, TC322759, TC322059, TC330654, TC282713, TC293173, TC281861, TC283253, TC283383, TC285032, TC290021, TC302716, TC283487, TC282866, TC283441，TC281428, TC285118, TC285090 ;来自 GenBank 数据库：AY967408, AF384145, AF384144, AY029312-AY029315, AY029317-AY029319， Z95352, AF369563-AF369565, AF369567, AF3