[0026] 高通量测序相对传统测序而言具有高通量、单位数据成本低、准确度高等特点。以 Illumina Hiseq2000为例，可产生3 X IO9序列/run，6 X IO11喊基/run。特别适合基因组 水平检测研究，逐渐为实验室研究和临床检测所采用。
[0027] 5与人类基因组序列进行对比的方法
[0028] 高通量测序产生的海量数据是传统序列比对软件（例如BLAST)所难适应的，针对 高通量测序数据的特点逐渐发展了一批专用的序列比对软件，如SOAP、bowtie、bwa等，适 于高通量数据序列短，数量大的特点，具有速度快、准确性高等优势。全基因组甲基化数据 中生物甲基化水平较低，实践操作中先将基因组序列中的C转化为T，再利用此类软件进行 比对。
[0029] 6甲基化水平统计方法
[0030] 衡量甲基化水平即统计特定区域内，例如基因组重复区，的甲基化C占区域内全 部C的比例，习惯把甲基化分为CG CHG CHH (H为A/C/T)3类甲基化，动物以CG甲基化为主。 统计可以使用各种市售统计软件进行，必要时，可以根据实验需要进行修改。
[0031] 7 癌症
[0032] 癌症是一大类恶性肿瘤的统称。癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体 内的营养物质被大量消耗；癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；癌细胞还可 转移到全身各处生长繁殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能 受损等。依据发生脏器的不同，常将其分为胃癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、肠癌、 子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、鼻咽癌、骨癌和 肾癌。特别是，胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、鼻因癌、肝癌和平滑肌肉瘤。
[0033] 8统计结果分析判断
[0034] 本发明将人类基因组划分为多个等单位长度的窗口，统计受试者低于健康人 平均值-η倍，优选3倍标准方差的窗口数目，窗口数目比例越多癌症风险越高。当设 置恰当的阈值时，可有效区分癌症病人及健康人。本发明的实施例证明，以IMb基因组 长度为窗口，将人类基因组划为多个窗口，统计每个窗口 CpG重复区内的甲基化比例， Z - Score =瑪―冗：=，其中，％ MDS_为样品的甲基化程度百分比， mean% MD,efe,enee为健康人甲基化程度平均值，SD,efe, enee为健康人甲基化程度标准方差。根 据如下的实施例，本发明人发现如果Z Score <-3的数据点（窗口数目）大于0%，优选大 于 0· 01%，0· 02%，0· 03%，0· 04%，0· 05%，0· 06%，0· 07%，0· 08% 或 0· 09%，更优选大于 0· 1%，0· 2%，0· 3%，0· 4%，0· 5%，0· 6%，0· 7%，0· 8%，或 0· 9%，进一步优选大 1%，进一 步优选大于2%，2. 1%，2. 2%，2. 3%，2. 4%，或2. 5%，进一步优选大于2. 8%，进一步优选 大于3. 4%，14%，15%，18%，或32%的受试者为癌症阳性。
[0035] 9.多类癌症评价
[0036] 为验证该方法在各类癌症的有效性，实验选取12例阳性样品，包括胃癌、结直肠 癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌、平滑肌肉瘤，以35例健康人做对照，结果显示健康人群对 照的Z Score < -3的数据点34例为0%，只有1个为0. 04%。癌症样品均远远大于0. 04%， 范围为0. 93% -32. 03%。结果表现出良好的特异性和准确性，说明该方法具有一般性。 实施例
[0037] 实施例1外周血采集和血浆分离
[0038] 1.采集受试者外周血至IOmL EDTA抗凝管（或血浆采集专用采血管，美国St reck 公司CF管）。受试者采取自愿原则，癌症样品来自北京大学肿瘤医院。
[0039] 2.取 1 支 IOmL EDTA 采血管 1600g 离心 IOmin。
[0040] 3.取上层血清转移到I. 5mL EP管中，注意枪头不要碰到中间层和底层红细胞层。
[0041] 4. 16000g 离心 lOmin。
[0042] 5.取上清转移至新的I. 5mL EP管中。
[0043] 6.可将纯出的血清-80°C冻存。
[0044] 实施例2测序文库的制备
[0045] 1.接头设计，其中全部C为5mC
[0046] 5， P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
[0047] 5， ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
[0048] 2.取2mL血浆抽提血浆游离DNA。
[0049] 3.末端补平
[0050] 制备如下的反应混合液
[0051]表 1
【主权项】
1. 一种无创癌症检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 从受试者采集外周血并分离血浆； 抽提血浆DNA并用亚硫酸氢盐处理； 将上述用亚硫酸氢盐处理后的血浆DNA用聚合酶扩增以制备测序文库； 对所制备的测序文库进行高通量测序； 将高通量测序得到的序列与人类基因组进行对比； 统计高通量测序得到的序列中基因组特定区域甲基化水平，并与健康人群确定的基因 组单位长度内甲基化水平进行对比，以判断所述受试者是否患有癌症。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中统计高通量测序得到的序列中基因 组重复区甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平平均值和标准方 差进行对比，统计甲基化水平低于平均值-nX标准方差的单位数目以判断所述受试者是否 患有癌症，其中n为1-5的整数。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中基因组单位长度为0. 5-5M，优选 1-3M，并且n为3。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因组重复区为基因组CpG重复 区。
5. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，其中以1M基因组长度为单位统 计CpG重复区内的甲基化比例，针对毎个单份窗口统计
其中，％MDsample为样品的甲基化程度百分比，mean%MDMfOTenee为健康人甲基化程度平 均值，为健康人甲基化程度标准方差。如果ZSc〇re<-3的单位数目的比例大于 〇%，优选大于0.04%，更优选大于0. 1%，进一步优选大于1%的受试者判断为癌症阳性。
6. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述高通量测序技术选 自Roche/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、AppliedBiosysternsSOLID和life Technologies/IonTorrent/Proton。
7. 根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于，在用亚硫酸氢盐处理抽提血浆DNA之 前，还包括用对所抽提的血浆DNA进行末端修复和连接甲基化接头的步骤。
8. 根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于，所述癌症选自胃癌、结直肠癌、平滑 肌肉瘤、肝癌、肺癌、肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺 癌、食道癌、鼻因癌、骨癌和肾癌。
9. 一种无创癌症检测试剂盒，其特征在于，包括，血浆DNA抽取试剂、高通量测序重测 序文库构建试剂、亚硫酸氢盐试剂、DNA扩增引物及扩增试剂、甲基化序列比对软件、重复区 甲基化水平统计软件。
10. 根据权利要求9所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，统计高通量测序得到的 序列中基因组特定区域甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平进 行对比，以判断所述受试者是否患有癌症。
11. 根据权利要求9或10所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，其中统计高通量测 序得到序列中基因组重复区甲基化水平，并与根据健康人群确定的基因组单位长度甲基化 平均值和标准方差进行对比，统计甲基化水平低于平均值-n倍标准方差的单位数目以判 断所述受试者是否患有癌症，其中n为1-5的整数。
12. 根据权利要求9或10所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，其中基因组单位长 度为0. 5-5M，优选1-3M，所述基因组重复区为基因组CpG重复区并且n为3。
13. 根据权利要求9-12任一项所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，其中 以1M基因组长度为单位统计CpG重复区内的甲基化比例，针对每个单位窗口统计
>其中，％MDsample为样品的甲基化程度百分比， mean%MD,efe,enee为健康人甲基化程度平均值，SD,efe,enee为健康人甲基化程度标准方差。如 果ZScore< -3的单位数目的比例大于0%，优选大于0. 04%，更优选大于0. 1%，进一步 优选大于1%的受试者判断为癌症阳性。
14. 根据权利要求9-12任一项所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 还包括高通量测序试剂。
15. 根据权利要求9-12任一项所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，所述所述癌 症选自胃癌、结直肠癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、肠癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺 癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌、食道癌、鼻咽癌、骨癌和肾癌。
16. 根据权利要求9-12任一项所述的无创癌症检测试剂盒，其特征在于，所述高通量 测序技术选自R〇che/454FLX、Illumina/Hiseq/Miseq、AppliedBiosystemsSOLID和life Technologies/IonTorrent/Proton。
【专利摘要】本发明公开了一种无创癌症检测方法，包括以下步骤：从受试者采集外周血并分离血浆；抽提血浆DNA并用亚硫酸氢盐处理；将上述用亚硫酸氢盐处理后的血浆DNA用聚合酶扩增以制备测序文库；对所制备的测序文库进行高通量测序；将高通量测序得到的序列与人类基因组进行对比；统计高通量测序得到的序列中基因组特定区域甲基化水平，并与健康人群确定的基因组单位长度内甲基化水平进行对比，以判断所述受试者是否患有癌症。本发明还公开了适用于上述检测方法的试剂盒。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104611410
【申请号】CN201310547104
【发明人】张亚晰, 李天成, 梁丹丹, 宋卓, 张建光
【申请人】北京贝瑞和康生物技术有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2013年11月4日