西瓜mlo型抗白粉病基因快速鉴定的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是借助于西瓜测序全基因组序列，利用植物比较基因组学、遗传学、生物信 息学和候选基因策略等方法快速鉴定西瓜白粉病基因，主要涉及到西瓜全基因组序列的下 载，候选基因的鉴定，基因的比对，聚类等手段，进而鉴定出白粉病基因，属于植物生物技术 科学领域。
【背景技术】
[0002] 西瓜（Citrullus Ianatus)属葫芦科，一年生蔓性草本植物。中国是世界上最大 的西瓜产地，西瓜的病害包括由真菌、细菌和病毒引起的多种病害。白粉病是由专性活体寄 生真菌引起，在大田和温室保护地西瓜栽培生产中广泛发生，喷洒杀菌剂和种植抗病品种 是防御此病的主要方法。但长期使用杀菌剂会危害环境安全，且易引起病菌小种变异产生 拮抗作用。推广种植抗病品种是安全、环保和高效的控制策略。常规育种实践中，对于抗白 粉病材料的选择是十分困难的：一方面选育周期长，需要经历杂交和回交复杂的选择程序； 另一方面白粉病的发生受到很多因素的综合影响，例如：温度、湿度和病菌小种等，鉴定抗 性材料的过程不容易控制。因此，挖掘白粉病基因将可以加快选育抗性品种的进程。
[0003] 西瓜白粉病由真菌子囊菌亚门瓜类单囊壳Sphaerotheca cucurbitae Jacz Z.Y. Zhao.和葫芦科白粉Erysiphe cucurbitacearum Zheng & Chen.侵染引起。但另有报 道，真菌子囊菌亚门专性寄生菌单丝壳白粉菌S. fulginea(Schlecht ex Fr. )Poll、二孢白 粉菌E·cichorocearum以及_草单囊壳菌S·humuliDC·Burro也能引起西瓜白粉病。根据 文献查找，发现我国瓜类白粉病菌种分化研究资料较少，工作滞后，这无形中阻碍了克隆瓜 类抗病基因的工作步伐。
[0004] 此病主要危害叶片，其次是叶柄和茎，一般不危害果实。发病初期叶面或叶背产生 白色近圆形星状小粉点，以叶面居多，当环境条件适宜时，粉斑迅速扩大，连接成片，成为边 缘不明显的大片白粉区，上面布满白色粉末状霉（即病菌的菌丝体、分生孢子梗和分生孢 子），严重时整叶面布满白粉。叶柄和茎上的白粉较少。病害逐渐由老叶向新叶蔓延。发病 后期，白色霉层因菌丝老熟变为灰色，病叶枯黄、卷缩，一般不脱落。当环境条件不利于病菌 繁殖或寄主衰老时，病斑上出现成堆的黄褐色的小粒点，后变黑（即病菌的闭囊壳）。西瓜 的不同生育期对白粉病的抵抗力也不同，一般是苗期或成株期的嫩叶抗病力强。
[0005] MLO型抗病基因是植物特异的一类抗病基因。人类最早发现MLO抗性始于 1937-1938年，德国人在埃塞俄比亚采集了很多品种的大麦，其中的两个株系对白粉病菌 (Biumeriograminisfs P. hordei，Bgh)所有已知的生理小种都具有高效抗性。进一步研究 表明，大麦MLO基因的隐性突变mlo可以使大麦对几乎所有已知大麦白粉病菌的生理小种 产生持久、广谱的抗性。最近，研究者发现很多植物的白粉病基因都是MLO型抗病基因控 制，如番茄，豌豆、拟南芥、蔷薇、辣椒、百脉根等等。因此挖掘植物中的MLO型抗病基因对植 物抗白粉病育种具有重要的作用。
[0006] 目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有图位克隆，转座子标签等方法。但是由于西 瓜的基础研究不够深入，因此利用这些方法不仅时间长而且很难准确地克隆这些基因。因 此，如何快速鉴定西瓜中的MLO型抗病基因将成为西瓜抗白粉病育种的重要前提。
[0007] 植物比较基因组学（Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对 已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利 用模式植物基因组与其它植物基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆其他植物基 因，揭示基因功能和分子机制，阐明物种进化关系及基因组的内在结构。本专利所采用的方 法及思路：模式植物拟南芥基因组研究已经揭示了 MLO型基因的功能，利用基因其顺序上 的同源性克隆西瓜MLO型抗病基因，根据模式植物拟南芥实验系统上的优越性和已知MLO 型抗病基因的特点，快速"捕捉"西瓜抗白粉病基因。本专利介绍了以西瓜全基因组序列为 前提，结合比较基因组学、遗传学、基因组学、生物信息学和候选基因策略等知识，快速挖掘 白粉病基因。
【发明内容】
[0008] 技术问题
[0009] 本发明的目的是提供一种通过结合植物比较基因组学、植物遗传学、基因组学和 生物信息学等知识，快速挖掘西瓜抗白粉病基因。其结果一方面可用于西瓜白粉病基因紧 密连锁分子标记的开发，进行分子标记辅助选择育种，另一方面也为其他作物白粉病基因 鉴定提供参考依据。
[0010] 技术方案
[0011] 主要原理：第一个植物抗白粉病基因（MLO)是从大麦中克隆的，研究发现此基因 是一类特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多数NBS(nucleotide-binding site)类型抗 病基因；随后，研究者相继从番茄、拟南芥、豌豆、辣椒、百脉根等植物中克隆了白粉病基因， 研究发现这些基因编码的都是MLO型抗病基因。随后，众多研究者通过多次试验证实MLO 型抗病基因已经成为植物特有的一类抗白粉病基因。进一步发现，植物MLO类型基因是一 个基因家族；而且对来源于不同物种的MLO基因家族进行系统发育关系分析发现，不同物 种中抗白粉病基因总是聚类一起，成为一类，这一类MLO基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。西瓜基因组测序的完成为挖掘白粉病基因提供了一条便利途径。因此，可以借 助于已经测序的西瓜全基因组中MLO基因家族和已经克隆的MLO白粉病基因的系统发育关 系以及对于维持白粉病基因 MLO重要功能的氨基酸保守性来鉴定西瓜白粉病基因。
[0012] 主要步骤如下：
[0013] 1)西瓜全基因组序列的下载及其MLO型基因的采集
[0014] 首先从西瓜测序基因组数据库（http://www. icugi. org/)下载西瓜全基因组序 列；使用"DNAT00LS"软件对获得的西瓜全基因组氨基酸序列数据建立数据库，然后用pfam 数据库（蛋白家族数据库，http://pfam. janelia.org/search/sequence)中的隐马尔可夫 模型（HMM)对MLO结构域的氨基酸序列与已建立的西瓜全基因组氨基酸序列数据库进行 Blastp (E-value = 0. 001)序列比对，初步筛选出候选基因序列。其次，利用已经公布的MLO 型基因序列，对西瓜基因组数据库进行BLAST比对，获得候选基因序列。
[0015] 2)西瓜MLO型基因家族的鉴定
[0016] 将上述结果中得到的同源核苷酸序列的候选基因，通过Pfam(E-valUe = 1.0)进 行分析，去除无'MLO'结构域的基因序列（图1)。再将候选抗病基因序列通过MEGA3. 1软 件提供的ClustalW工具（多序列比对程序）进行多序列比对，去除重复序列。
[0017] 3)通过植物MLO型基因的系统发育关系鉴定候选的西瓜MLO型白粉病基因
[0018] 由于先前的研究已经证明，双子叶植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系统 发育树同一区组，因此在系统发育关系研究中，我们把拟南芥的MLO型基因家族和一些其 他作物的MLO型抗白粉病基因和西瓜MLO型基因一起聚类分析，以获得候选的西瓜抗白粉 病基因（图2)。
[0019] 4)西瓜白粉病基因与已知的植物MLO白粉病基因的比对
[0020] 利用BioXM2. 6软件将西瓜候选的MLO型白粉病基因和拟南芥、番茄、豌豆、大麦的 MLO白粉病基因的氨基酸序列转换成Fasta格式的文件，将这些文件导入Bi〇Edit7. 0软件， 运用此软件中Clustal软件进行多序列比对，揭示候选白粉病基因重要氨基酸残基及区域 的保守性。从而进一步鉴定西瓜候选的白粉病基因（图3)。
[0021] 本发明的积极效果：
[0022] 1)缩短了西瓜白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鉴定。采用常规方 法（图位克隆、转座子标签等）挖掘抗白粉病基因不仅耗时耗力、效率低，且难以成功。本 发明基于植物比较基因组学、遗传学、生物信息学方法快速挖掘西瓜白粉病基因，不仅可以 缩短时间，还可以提高白粉病基因鉴定效率。
[0023] 2)西瓜（Citrullus Ianatus)是全世界重要水果作物之一。由于西瓜遗传基础狭 窄，种质资源多样性低，因此通过常规的分子标记（RAPD、ISSR、SSR、AFLP等）鉴定西瓜白 粉病基因比较困难。通过鉴定的候选白粉病基因开发相应的共分离功能性标记（SNP、SCAR 等），可以快速的用于抗病基因的分子标记辅助选择，进行多抗性育种材料的创制，可以缩 短育种年限，提高育种效率。
[0024] 3)为阐述西瓜抗白粉病分子机制奠定了基础。西瓜抗白粉病基因的鉴定，通过转 基因技术、RNAi、病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技术等研究 抗白粉病的分子机制提供了基因资源，有利于快速阐述西瓜抗白粉病的作用机理。
【附图说明】
[0025] 图1西瓜MLO基因的鉴定；
[0026] 本图显示的是14个MLO型基因鉴定结果，每一个基因都含有一个'ML0'保守结构 域。
[0027] 图2植物MLO基因家族的系统发育关系分析及其西瓜MLO型白粉病基因的鉴定；
[0028] 拟南芥是植物科学研究的模式植物，在构建系统发育树中，拟南芥的15个MLO型 基因（其中3个基因是白粉病基因：AtML002, AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (SlMLO)、大麦白粉病基因（HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被选择用来和 西瓜MLO型基因聚类分析。共鉴定出3个西瓜候选的MLO型白粉病基因。图中斜体标记的 基因就是候选西瓜白粉病基因。
[0029] 图3西瓜MLO型白粉病基因的比对分析；
[0030] 3个西瓜白粉病基因与大麦（HvMLO)、番茄（SlMLO)、豌豆（PsMLO)、拟南芥白粉病 基因（AtML002, AtML006和AtML012)进行比对，鉴定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸残基 和区域的保守型。图中TM1-TM7表示西瓜MLO型白粉病基因的7个转模区域；黑色圆点表 示白粉菌侵染重要的氨基酸残基；CaMBD表示钙调蛋白结合区；I和II表示对白粉菌侵染 重要的氨基酸区域。
【具体实施方式】
[0031] 抗病基因的鉴定在作物抗病遗传理论研究和抗病品种选育中具有重要的作用。本 方法可以快速鉴定出西瓜白粉病基因。具体实施过程如下：
[0032] 1)西瓜MLO型基因的采集
[0033] 为了获得西瓜全部的MLO型基因家族成员，我们首先以拟南芥的MLO型基因，番 茄、豌豆、辣椒、蔷薇、辣椒、百脉根的抗白粉病MLO基因序列构建HMM模型，从西瓜基因组序 列中检索MLO型基因；其次以不同作物中已经发表的MLO基因序列作为靶序列（来自DFCI 数据库：TC171015, TC267529, DFCI :TC