专利名称：一种利用专性厌氧丁酸梭菌发酵制氢的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用微生物厌氧发酵制氢的方法，尤其是一种利用高效厌氧菌制 氢的方法。
背景技术：
氢气的燃烧热值高，为汽油的3倍，唯一燃烧产物为水，对环境无污染，因此氢能 可谓是清洁、高效、可再生的绿色能源。
氢能不是一次能源，需要从含氢的化合物中制取。目前全世界90%以上的氢来自 化石燃烧，其余为水电解制氢。不论是哪种制氢方法都要直接或间接消耗大量的化石能源。 化石燃料储量有限，且趋于枯竭，同时，化石燃料燃烧时生成的温室气体，有毒气体等其他 有机化合物，造成了严重的环境污染并使得全球气候发生变化。生物制氢以其原料来源丰 富、价格低廉等特点越来越收到人们的关注，一旦规模化生产，将会是最有潜力的一种制氢 方法。
生物制氢想法最先是在1966年由lewis提出的，然后20世纪70年代经历的石油 危机使全球认识到了生物制氢的实用性和迫切性。直到90年代，当世界面临着能源与环境 的双重压力时，生物制氢被再度提上了议事日程。生物制氢包括光合生物制氢和厌氧发酵 制氢两种途径。后者具有产氢率高、产氢速率快、产氢持续稳定、反应装置的设计操作简单、 原料来源广泛且成本低等特点，更易于实现规模化生产，因而成为生物制氢研究的主要方 向。厌氧发酵制氢菌种包括专性厌氧菌和兼性厌氧菌，其中，专性厌氧菌的培养、运输及工 业化条件苛刻，而兼性厌氧菌具有广泛的适应性，但兼性厌氧菌产氢效率没有专性厌氧菌 高，在适当条件下合理培养，可以克服其缺点，专性厌氧菌将会是生物制氢工业化更理想的 细菌。目前，专性厌氧菌种类比较少，缺乏新型菌种，产氢效率偏低，并且制氢条件待进一步 优化。
通过专利检索，目前已有专利主要是对发酵底物、发酵装置和提高产氢效率的研 究，如一种污泥与有机垃圾混合生物制氢的方法(申请号200710032658. 0周少奇等)，光 合微生物制氢反应器(申请号200620032^2. 4)，生物发酵制氢装置(申请号00231651. X沈建权)，一种利用CO2使藻类快速增殖直接用于生物制氢的方法(200710010804. X) 和高效发酵法生物制氢膨胀床设备(申请号03260012. 7任南琪等)等，而对于发酵菌种 特别是高效产氢菌种的筛选研究相对薄弱，仅有一种生物制氢方法及其专用菌(申请号 200910088408. 8邢新会等)，但该方法所用菌种是通过基因导入后的重组菌，操作较复杂， 且发酵条件要求严格厌氧，不易推广。所以，对于新型专性厌氧新型菌种的筛选以及制氢工 艺条件的探索优化十分必要
发明内容
本发明主要包括一种利用专性厌氧丁酸梭菌发酵制氢的方法，该方法是在严格厌氧条件下，使用丁酸梭菌LMG1217 (Clostridium butyricum) JCM1391，以葡萄糖为发酵底 物，采用分批发酵的方式二4小时后即可开始产氢过程。
本发明的技术方案是一种利用专性厌氧丁酸梭菌发酵制氢的方法，在无菌厌氧 条件下，利用厌氧菌，以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、Na2HPO4、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐 酸盐一水、刃天青指示和蒸馏水组成的混合物为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发 酵的方式进行制氢，所述的厌氧菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum) JCM1391。
培养基的组成为蛋白胨10. 0 15. 0g、牛肉膏2. 0 3. 0 g、酵母提取物5. 0 10. Og^Na2HPO4 3. 0 4. 0g、L_半胱氨酸0. 2 0. 5g、L_半胱氨酸盐酸盐一水0. 2 0. 5g、 0.2% wt的刃天青指示剂ImL和蒸馏水1L。
所述的发酵底物葡萄糖的浓度为5. 0 10. Og/L具体步骤为无菌厌氧环境下，将培养基用磷酸盐缓冲液调pH为7. 0 7. 5，水浴加热 瓶内培养基，同时从瓶口充氮气5分钟，待液相变为无色，最后封上瓶盖，115°C高温灭菌， 烘干后将丁酸梭菌的菌株接种至装有培养基的瓶中，在37 40°C条件下静置培养至细胞 干重达0. 658g/L后作为接种物，然后将接种物与培养基按体积比1 :10的比例接种于发酵 瓶中的培养基中得到发酵液；于37 40°C条件下进行恒温振荡培养，连续产氢。
本发明所筛选的专性厌氧菌在细菌学分类中归属于梭菌属(Clostridium Prazmowski, 1880),为革兰氏阳性厌氧杆菌，名称是丁酸梭菌(Clostridium butyricum) JCMl391,购自日本生物技术研究所微生物菌种保藏中心(Marine Biotechnology Institute Culture Collection, Marine Biotechnology Institution, MBIC)。
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)为专性厌氧菌，对培养环境氧气要求比较严 格。本发明经过对发酵条件组合配置试验，找到最佳工艺条件使达到该专性厌氧菌最佳产 氢量。细菌扩大培养，发酵接种都在厌氧箱内操作，并采用分批发酵的方式；该条件下产氢 效率高，对发酵环境条件要求低，具有广阔的应用前景。
有益效果首先，筛选出一种新型发酵制氢菌种，此菌种为专性厌氧菌，具有生长迅速，产氢效率 高等优点；其次，确定了发酵工艺条件，确定发酵底物为浓度是5. 0 10. 0g/L的葡萄糖，培养 基配制为蛋白胨10.0 15. 0g，牛肉膏2.0 3.0 g，酵母提取物5.0 10. 0g, Na2HPO4 3. 0 4. 0g, L-半胱氨酸0. 2 0. 5g，L-半胱氨酸盐酸盐一水0. 2 0. 5g，刃天青指示剂 (0.2%) ImL,蒸馏水IL ；培养基用磷酸盐缓冲液调pH为7. 0 7. 5，水浴加热瓶中液体并充 氮气5分钟，试管内保持厌氧环境，发酵和接种都在厌氧箱内操作，采用分批发酵的方式； 于37 40°C条件下静置培养M小时作为接种物，然后按接于发酵瓶中，37 40°C条件下 进行恒温振荡培养，可以连续产氢。
图1为本发明的装置。
其中，1为氮气冲洗口和液体取样口，2为气体取样口，3为气体收集管，4为水准 瓶。
图2为菌液OD值随时间变化曲线。4
图3为产氢量随时间变化曲线。
图4为方案一和方案二的氢气产量变化曲线。
具体实施方式
一种利用专性厌氧丁酸梭菌发酵制氢的方法，在无菌厌氧条件下，利用厌氧菌，以 蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、Na2HPO4、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水、刃天青指示和 蒸馏水组成的混合物为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方式进行制氢，所述 的厌氧菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum) JCM1391。
培养基的组成为蛋白胨10. 0 15. 0g、牛肉膏2. 0 3. 0 g、酵母提取物5. 0 10. Og^Na2HPO4 3. 0 4. 0g、L_半胱氨酸0. 2 0. 5g、L_半胱氨酸盐酸盐一水0. 2 0. 5g、 0.2% wt的刃天青指示剂ImL和蒸馏水1L。
所述的发酵底物葡萄糖的浓度为5. 0 10. Og/L具体步骤为无菌厌氧环境下，将培养基用磷酸盐缓冲液调pH为7. 0 7. 5，水浴加热 瓶内培养基，同时从瓶口充氮气5分钟，待液相变为无色，最后封上瓶盖，115°C高温灭菌， 烘干后将丁酸梭菌的菌株接种至装有培养基的瓶中，在37 40°C条件下静置培养至细胞 干重达0. 658g/L后作为接种物，然后将接种物与培养基按体积比1 :10的比例接种于发酵 瓶中的培养基中得到发酵液；于37 40°C条件下进行恒温振荡培养，连续产氢。
菌种的扩大培养实施例1 菌种厌氧操作技术的选择确定 配制基础培养基(1)方案一培养液组分为蛋白胨10g/L，牛肉膏2. 4 g/L，酵母提取物5. Og/L,Na2HPO4 4g/L，L-半胱氨酸0. 2 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐一水0.5 g/L，蒸馏水1000mL。调节pH=7. 0， 每IOOmL培养液装入250mL锥形瓶，内层用纱布包裹，外层包报纸封口。120°C高温灭菌 25min，于60°C烘箱中烘干后，将菌株Clostridium butyricum接种至装有培养基的瓶中 (无菌厌氧操作)，于37°C下静置培养M 48h。
(2)方案二与上述培养液组分基本相同，此外，另添加刃天青指示剂(0. 2% ) lmL/L。调节ρΗ=7· 0,每IOOmL培养液装入250mL盐水瓶(带瓶塞，能密闭)，水浴加热 瓶内液体，同时从瓶口吹入氮气，待液相变为无色(瓶内为无氧环境)，封上瓶盖。120°C高 温灭菌25min，于60°C烘箱中烘干后，将菌株Clostridium butyricum接种至装有培养基的 瓶中(无菌厌氧操作)，于37°C下静置培养M 48h。
在培养过程中，用756紫外可见分光光度计在600 nm处定时测定样品的吸光度 值，绘制菌液OD值随时间变化曲线，细菌生长OD值随时间变化见附图2。
实验结果表明方案二(严格厌氧条件)细菌总生长时间为40h，最终0D_值为 1.425，细菌繁殖迅速，厌氧条件控制的好，适合细菌生长。方案一(非严格厌氧条件)细菌 总生长时间为48h，最终OD6tltl值为1. 109。虽然方案一没有严格按照厌氧条件培养细菌，但 是细菌还是能够生长。显然，方案二对细菌生长更有优势。
菌种的发酵产氢实施例2 菌种发酵环境的选择确定发酵培养基组分为蛋白胨10g/L，牛肉膏2. 4 g/L，酵母提取物5. Og/L, Na2HPO4 4g/ L，L-半胱氨酸0. 2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐一水0. 5g/L，刃天青(0. 2% ) lmL/L,葡萄糖 10g/L ；调节初始pH=7. 0 ；配制培养基过程中，利用常规的加热煮沸驱逐液相溶解氧和利用 氮气吹脱瓶内气相空气的方式，保证严格厌氧于115°C高温灭菌25min ；无菌厌氧操作，将 Clostridium butyricum高浓度菌液(细胞干重达0. 658g/L)以体积比1 10比例接种于 200ml的培养基中得到发酵液，在37°C的厌氧箱内静置培养(1)方案一将接种好的一瓶发酵液，总量为220mL，封闭后取出厌氧箱，于温度为 370C、170r/min的摇床振荡培养并连氢气接收集装置。
(3)方案二 将另一瓶220mL发酵液封闭后取出厌氧箱，于温度为37°C的水浴锅中 静置培养，并连氢气收集装置。
在培养过程中，收集方案一(恒温振荡发酵)和方案二(恒温静置发酵)的气体并 实时记录气体产量，定时取方案一中发酵液样测定细菌0D_值和葡萄糖分解率等指标；细 菌0D_值用756紫外可见分光光度计在600 nm处测定；氢气含量测量采用气相色谱仪TCD 热导器检测；葡萄糖分解率采用菲林比色法测定，产氢量随时间变化见附图3。
实验结果表明方案一产气总持续时间约23个小时，初始为菌种的繁殖阶段， 产气速率低，在1(Γ15小时产气速率最高，最终产气量^7mL，氢气量169. 67mL,氢气比率 63. 5%，葡萄糖转化率为50. 87% ；方案二产气总持续时间约35个小时，初始为菌种的繁殖阶 段，产气速率低，产气速率稳定，最终产气量153mL，氢气量32. 19mL,氢气比率21. 04%,葡萄 糖转化率为63. 04%。对比发现，方案一产氢速度快，氢气百分比高，且葡萄糖利用率高，优势 明显，适合于发酵过程中应用。
JCM1391 丁酸梭菌为专性厌氧产氢菌 实施例3 新型丁酸梭菌发酵产氢发酵培养基组分为蛋白胨10g/L，牛肉膏2. 4 g/L，酵母提取物5. 0g/L，Na2HPO4 4g/L， L-半胱氨酸0. 2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐一水0. 5g/L，刃天青(0. 2%)lmL/L,葡萄糖IOg/ L ；调节初始pH=7.0 ；配制培养基过程中，利用加热煮沸驱逐液相溶解氧和利用氮气吹脱瓶 内气相空气的方式，保证严格厌氧于115°C高温灭菌25min ；将Clostridium butyricum高 浓度菌液以1 :10比例接种于200ml发酵培养基，无菌厌氧操作，在37°C的厌氧箱内静置培 养(1)方案一将丁酸梭菌JCM1391接种至一瓶发酵液，总量为220mL，封闭后取出厌氧 箱，于温度为37°C、170r/min的摇床振荡培养并连氢气接收集装置。
( 方案二 将丁酸梭菌Asl. 209(购于中国普通微生物菌种保藏中心)接种至 一瓶发酵液，总量为220mL，封闭后取出厌氧箱，于温度为37°C、170r/min的摇床振荡培养 并连氢气接收集装置。
在培养条件和产氢工艺相同的条件下，只是菌不同，收集方案一和方案二的气体 绘制最终氢气产量如图4。最终方案一氢气总产量为168mL，方案二中无气体产生。因此 结果证明同属的丁酸梭菌并不是都能发酵产氢，所筛选的丁酸梭菌JCM1391可用来发酵制Μ,ο
在厌氧条件下，微生物发酵生成丙酮酸的反应在不同的菌种中是一致的，但是不 同的微生物菌种厌氧代谢的副产物是不尽相同的，即丙酮酸有多个代谢途径。在丁酸梭菌中，细胞在铁蛋白氧化还原酶的作用下生成乙酰CoA，并释放出(X)2和氢气，乙酰CoA进一 步代谢最终主要生成乙酸和丁酸；有时也可以伴随有甲酸和正丁醇的生成，而没有氢气生 成。
综上所述，丁酸梭菌(Clostridium butyricum) JCM1391作为专性厌氧产氢菌种， 可用于发酵底物为葡萄糖的发酵制氢过程中，通过试验发现，其发酵制氢的一般工艺条件 是①细菌的最佳厌氧操作技术是利用加热煮沸驱逐液相溶解氧和利用氮气吹脱瓶内气相 空气的方式，保证严格厌氧；②最佳菌种接种时机为基础培养基与发酵底物共存时；③培 养基配制为蛋白胨 ο. O 15. Og，牛肉膏2. O 3. O g，酵母提取物5. O 10. OgjNa2HPO4 3. 0 4. Og, L-半胱氨酸0. 2 0. 5g，L-半胱氨酸盐酸盐一水0. 2 0. 5g，刃天青指示剂 (0. 2% ) lmL，蒸馏水IL ；④发酵底物葡萄糖的浓度为5. 0 10. Og/L ；⑤发酵温度为37 400C ；⑥发酵初始pH为7. 0 7. 5 ；⑦在震荡条件下发酵液产氢效率更高。
权利要求
1.一种利用专性厌氧丁酸梭菌发酵制氢的方法，其特征在于，在无菌厌氧条件下，利用 厌氧菌，以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、Na2HPO4、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水、刃 天青指示和蒸馏水组成的混合物为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方式进 行制氢，所述的厌氧菌为丁酸梭菌(Clostridium butyricum) JCM1391。
2.如权利要求1所述的利用专性厌氧丁酸梭菌发酵制氢的方法，其特征在于，培养基 的组成为蛋白胨10. 0 15. 0g、牛肉膏2. 0 3. 0 g、酵母提取物5. 0 10. 0g、Na2HPO4 3. 0 4. 0g、L-半胱氨酸0. 2 0. 5g、L-半胱氨酸盐酸盐一水0. 2 0. 5g、0. 2% wt的刃 天青指示剂ImL和蒸馏水1L。
3.如权利要求1所述的利用专性厌氧丁酸梭菌发酵制氢的方法，其特征在于，所述的 发酵底物葡萄糖的浓度为5. 0 10. Og/L如权利要求1所述的利用专性厌氧丁酸梭菌发酵制氢的方法，其特征在于，具体步骤 为无菌厌氧环境下，将培养基用磷酸盐缓冲液调pH为7. 0 7. 5，水浴加热瓶内培养基， 同时从瓶口充氮气5分钟，待液相变为无色，最后封上瓶盖，115°C高温灭菌，烘干后将丁酸 梭菌的菌株接种至装有培养基的瓶中，在37 40°C条件下静置培养至细胞干重达0. 658g/ L后作为接种物，然后将接种物与培养基按体积比1 :10的比例接种于发酵瓶中的培养基中 得到发酵液；于37 40°C条件下进行恒温振荡培养，连续产氢。
全文摘要
本发明提供了一种利用专性厌氧丁酸梭菌发酵制氢的方法，筛选出的专性厌氧菌为丁酸梭菌JCM1391；通过试验发现，在无菌厌氧条件下，利用厌氧菌，以蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、Na2HPO4、L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水、刃天青指示和蒸馏水组成的混合物为培养基，以葡萄糖为发酵底物，采用分批发酵的方式进行制氢。培养基的组成为蛋白胨10.0～15.0g、牛肉膏2.0～3.0g、酵母提取物5.0～10.0g、Na2HPO4 3.0～4.0g、L-半胱氨酸0.2～0.5g、L-半胱氨酸盐酸盐一水0.2～0.5g、0.2％wt的刃天青指示剂1mL和蒸馏水1L。产氢效率高，对发酵环境条件要求低。
文档编号C12P3/00GK102041274SQ20101058648
公开日2011年5月4日 申请日期2010年12月14日 优先权日2010年12月14日
发明者王瑞兴, 钱春香, 陈璐圆 申请人:东南大学