一种基于srap标记的亚麻杂交种种子纯度鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于SRAP标记的亚麻杂交种种子纯度 鉴定的方法。
【背景技术】
[0002] 亚麻属于亚麻科一年生草本植物，是重要的纤维作物和油料作物。亚麻为自花授 粉作物，雄性不育系是杂优利用的关键。1998年，我国发现了具有温光敏特性、隐性遗传的 核雄性不育系，利用温敏特性和隐性遗传特性，可以实现不育性的保持和恢复，并且容易配 制组合，在亚麻杂种优势利用上显示了巨大的应用价值（党占海，张建平，佘新城.温敏 型雄性不育亚麻的研宄[J].作物学报，2002, 28(6) :861?864)，并相继选育成功了世界首 批胡麻杂交种陇亚杂1号，陇亚杂2号等胡麻杂交种。
[0003] 目前，鉴定亚麻杂交种纯度主要依靠田间种植检测法。虽然传统的田间形态学鉴 定仍是目前最为普遍使用的品种真实性和种子纯度鉴定方法，但由于其受环境和基因显隐 性等的影响颇大，人们对其可靠性已产生了置疑。特别在种子贸易仲裁检验中，对不发芽的 种子和形态相近的材料，仅靠传统鉴定的方法是很难提供可靠证据的。
[0004] 随着生物技术的发展及其在作物育种中应用的不断深入，科学家们提出了应用分 子标记技术进行农作物品种的遗传和真实性鉴定。基于DNA基础的分子标记不受环境限制 和影响、无表型效应，具有客观、稳定、快速、高效等特点，因此，分子标记技术在杂交种纯度 检测中得到了快速应用。
[0005] 近年来关于分子标记在种子纯度检测中的应用已有很多，例如西瓜、瓠瓜、 花生等作物的运用，但是，尚未见应用分子标记进行亚麻杂交种种子纯度检验报道。 SRAP (Sequence一related amplified polymorphism)，相关序列扩增多态性，是一种新型 的基于PCR的标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros于2001年提出，SRAP的 原理是利用独特的引物设计对〇RFs(open reading frames)进行扩增，上游引物长17 bp， 5'端的前10 bp是一段填充序列，紧接着是CCGG，它们组成核心序列及3'端3个选择碱 基，对外显子进行特异扩增。下游引物长18 bp，5'端的前10?11 bp是一段填充序列，紧 接着是AATT，它们组成核心序列及3'端3个选择碱基，对内含子区域、启动子域进行特异扩 增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。SRAP操作简便， 使用长17-18 bp的引物以及50°C的退火温度，保证了结果的稳定性。通过改变SRAP引物 3'端3个选择碱基可得到更多的引物，由于上游与下游引物可自由组配，因此用少数的引 物可进行多种组合，大大减少了合成引物的费用，同时也提高了引物的使用率。SRAP操作简 便、扩增结果稳定、高效、重复性好等优点，已经被应用于图谱构建、比较基因组学、遗传多 样性分析和标定基因的研宄中。
[0006] 迄今为止，尚未见应用SRAP标记成功进行亚麻杂交种种子纯度检验的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于公开了一种基于SRAP标记的亚麻杂交种种子纯度鉴定的方 法。
[0008] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种基于SRAP标记的亚麻杂交种 种子纯度鉴定的方法，包括以下步骤：
[0009] 1)提取亚麻总基因组DNA ;
[0010] 2)利用SRAP引物组合M10/E3,以"陇杂1号"基因组DNA为模板进行PCR扩增， 或利用SRAP引物组合M2/E5,以"陇杂2号"基因组DNA为模板进行PCR扩增；
[0011] 3)将扩增后的DNA片段，利用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测SRAP扩增产物；
[0012] 4)对电泳结果进行分析，将同时具有双亲特异性标记条带的单株判定为真正的杂 交种，计算种子遗传纯度，计算方法为，通过计算供试种子样品中杂交种数量占总样品数量 的比例确定种子纯度。
[0013] 进一步的，上述的一种基于SRAP标记的亚麻杂交种种子纯度鉴定的方法，所述 SRAP引物组合M10/E3序列为：
[0014] 正向引物 MlO :SEQ ID No. 1 ;
[0015] 反向引物 E3 :SEQ ID No. 2 ;
[0016] 所述SRAP引物组合M2/E5序列为：
[0017] 正向引物 M2 :SEQ ID No. 3 ;
[0018] 反向引物 E5 :SEQ ID No. 4。
[0019] 分别运用两对SRAP引物以提取的陇杂1号和陇杂2号与其父母本单株基因组为 模板进行PCR扩增，应用非变性聚丙烯凝胶电泳检测PCR扩增产物；只有同时具有亲本特异 条带的单株才为真正的杂交种，缺少任一亲本条带均为假杂交种；所述的鉴定陇杂1号杂 交种种子纯度的SRAP引物对M10/E3 ;鉴定陇杂2号杂交种种子纯度的SRAP引物对M2/E5。
[0020] 上述用于鉴定陇杂1号种子纯度的SRAP引物组合M10/E3中，上游引物序列MlO : 5' -TGA GTC CAA ACC GGA AA-3'，下游引物序列 E3 :5' -GAC TGC GTA CGA ATT GAC-3'。
[0021] 上述用于鉴定陇杂2号种子纯度的SRAP引物组合M2/E5中，上游引物序列： M2:5'-TGA GTC CAA ACC GGA GC-3'，下游引物序列E5:5'-GAC TGC GTA CGA ATT AAC-3'。
[0022] 进一步的，上述的一种基于SRAP标记的亚麻杂交种种子纯度鉴定的方法，所述 SRAP-PCR 反应体系的总体积为 25 yL，体系包含 10XPCR Buffer 2 yL、25mmol/LMg2+2 yL、 2· 5 mmol/L dNTPs 3 μ L、2. 5 U Taq 酶 0· 5 μ L、30ng/ μ L 模板 DNA 2 μ L 及 25ng/ μ L 引物 各1 μ L，其余用ddH20补足；
[0023] PCR扩增程序为：94°C预变性 3 min，94°C变性45 S，34. 5°C退火20 S，72°C延伸 60 S，共5个循环；然后，再94°C变性45 S，50°C退火20 S，72°C延伸60 S，共38个循环；最后 72°C 延伸 10min，4°C 保存。
[0024] 扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，每孔上样量定为6.0yL，电压100 V(4V/ cm)电泳60 min，电极缓冲液为I X TBE。0. 05% EB染色，紫外凝胶呈像系统下观察、照相和 分析。用IOObp DNA Marker作为分子量的标准。
[0025] 通过分析