一种玉米品种丹玉39号纯度检测的ssr分子标记试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种分子标记检测试剂盒，特别是设及一种玉米品种丹玉39号纯度 检测的SSR分子标记试剂盒。
【背景技术】
[0002] 玉米是我国的重要作物，在农业生产中占有重要地位。玉米种子质量直接影响产 量，玉米种子纯度是评价种子质量的重要指标。实践中，我国玉米种子纯度鉴定仍W巧粒形 态鉴定、幼苗鉴定和田间小区种植鉴定为主体，辅W同工酶和蛋白质电泳技术。
[0003] 利用种子、幼苗或者株型等形态差异鉴定纯度的方法费时费力、受环境和基因显 隐性等的影响较大，检测结果易出现偏差。同工酶和蛋白质电泳技术具有简单、快速、成本 低等优点，然而，而且随着玉米品种的数量逐年增多，种质资源狭窄，同质化问题愈显突出， 难W找到杂交种特征带，难W进行有效的品种纯度检测。
[0004] 利用SSR分子标记技术对玉米品种纯度鉴定的优越性在于：（1 )SSR分子标记数量 大，特异性高，可鉴定表型难于鉴别的品种；（2)SSR分子标记不受任何环境因素的影响，可 在生长发育的任何阶段取材鉴定；（3)SSR分子标记呈共显性遗传，操作灵活、简便、快速， 易于分析；（4)利用SSR分子标记鉴定品种，不仅准确可靠，而且还便于实现标准化。
[0005] 玉米品种丹玉39号是丹东农业科学院和迂宁东亚玉米种子公司于2001年迂宁省 审定的品种，迂审玉巧001] 121号，WC8605-2为母本，W丹598为父本组配而成的。株高 281厘米，穗位118厘米，穗长20厘米，株型清秀，巧粒枯黄色，马齿型。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种玉米品种丹玉39号纯度检测的SSR分子标记试剂盒， 用W检测玉米品种丹玉39号的纯度，本试剂盒具有快速、准确、简便等优点，可W及时准确 的检测出纯度结果，能够减少假劣种子坑农害农案件的发生，保证粮食种植安全。
[0007] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的： 一种玉米品种丹玉39号纯度检测的SSR分子标记试剂盒，W玉米品种丹玉39号及父 母本双亲的基因组DNA为模板，通过对覆盖全基因组200对SSR引物进行筛选，获得两对双 亲互补特异性高、重复性好、结果稳定的SSR引物，SEQIDNO:1和2和SEQIDNO:3和4。
[0008]沈Q ID NO :1序列（5'一3'）GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG 沈Q ID NO :2序列（5'一3'）CACGTACGGCAATGCAGACAAG 沈Q ID NO :3序列（5'一3'）CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG沈Q ID NO :4序列（5'一3'）CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTG 所述的一种玉米品种丹玉39号纯度检测SSR分子标记试剂盒，W玉米品种丹玉39号 的基因组DNA为模板，WSEQIDNO:1和2或SEQIDNO:3和4为SSR特异性引物，进行 PCR扩增。
[0009] 所述的一种玉米品种丹玉39号纯度检测SSR分子标记试剂盒，PCR反应体系总体 积 20μL，包括 14. 1μL超纯水、2μL10 倍PCR缓冲液、1. 2μLdNTPs(2. 5mmol/L)、0. 5μLSSR引物（0.25μmol/L)、0.2μL7?每DNA聚合酶（2.5U/μL)、2μLDNA，混匀。
[0010] 所述的一种玉米品种丹玉39号纯度检测SSR分子标记试剂盒，反应程序为94°C 预变性5min;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循环35次；72°C延伸5min;4°C保 存。
[0011] 所述的一种玉米品种丹玉39号纯度检测的SSR分子标记试剂盒，纯度结果通过带 型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示。
[0012] 试剂盒中还可包括抽提样品DNA所需的各种试剂。运些试剂是本领域技术人员周 知的。
[0013] 本发明的优点与效果是： 1.本发明在对覆盖玉米全基因组的200对SSR引物进行筛选，获得两对双亲互补特异 性高、重复性好、结果稳定的SSR引物，由其两对特异性引物和7?城每等试剂开发出针对玉 米品种丹玉39号纯度检测的试剂盒，可W快速、准确、简便的检测出玉米品种丹玉39号的 纯度，为品种管理和市场监管提供技术支撑，还对保证粮食种植安全具有一定的指导意义。
[0014] 2.本发明的试剂盒具有快速、准确、简便等优点，可W及时准确的检测出纯度结 果，能够减少假劣种子坑农害农案件的发生，保证粮食种植安全。
[0015] 3.本发明的试剂盒可为品种管理和市场监管提供技术支撑。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明的SEQIDNO:1和2扩增玉米品种丹玉39号及父母本结果图； 图2为本发明的SEQIDNO:3和4扩增玉米品种丹玉39号及父母本结果图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[001引本发明的检测过程为： (1)玉米品种丹玉39号基因组DNA提取随机数取100粒种子，采取CTAB法进行DAN提 取。（2)PCR扩增W沈QIDNO:1和2或沈QIDNO:3和4为SSR特异性引物，配制20ul PCR反应体系。
[001引（3)PCR反应体系总体积20μL，包括14. 1μL超纯水、2μL10倍PCR缓冲液、 1.2μΙdNTPs(2. 5mmol/L)、0. 5μΙSSR特异性引物（0. 25ymol/L)、0. 2μΙra^/DNA聚合 酶（2. 5U/μL)、2μLDM，混匀。
[0020] (4)反应程序为94°C预变性5min;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 环35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0021] (5 )电泳检测对PCR产物进行聚丙締酷胺凝胶电泳检测。
[0022] (6)纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子 粒数的百分率表示。
[0023] 实施例1 本实施例中用玉米品种丹玉39号纯度检测SSR分子标记试剂盒，检测玉米品种丹玉39 号样品A的纯度。操作流程如下： 1)随机数取玉米品种丹玉39号样品A100粒种子，采取CTAB法进行DAN提取。
[0024] (2)PCR扩增W沈QIDNO:1和2为SSR特异性引物，配制20ulPCR反应体系。
[002引（3)PCR反应体系总体积20μL，包括14. 1μL超纯水、2μL10倍PCR缓冲液、 1.2μΙdNTPs(2. 5mmol/L)、0. 5μΙSSR特异性引物（0. 25ymol/L)、0. 2μΙra^/DNA聚合 酶（2. 5U/μL)、2μLDM，混匀。
[0026] (4)反应程序为94°C预变性5min;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 环35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0027] (5)电泳检测对PCR产物进行聚丙締酷胺凝胶电泳检测。
[0028] (6)纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子 粒数的百分率表示。
[0029] 具有本品种特异带型的种子粒数为96,按公式：
玉米品种丹玉39号样品A纯度为=96/100=96%。
[0030] 实施例2 本实施例中用玉米品种丹玉39号纯度检测SSR分子标记试剂盒，检测玉米品种丹玉39 号样品B的纯度。操作流程如下： 1)随机数取玉米品种丹玉39号样品B100粒种子，采取CTAB法进行DAN提取。
[0031] (2)PCR扩增W沈QIDNO:3和4为SSR特异性引物，配制20ulPCR反应体系。
[00础 （3)PCR反应体系总体积20μL包括14. 1μL超纯水、2μL10倍PCR缓冲液、 1.2μΙdNTPs(2. 5mmol/L)、0. 5μΙSSR特异性引物（0. 25ymol/L)、0. 2μΙTaqDNA聚合 酶（2. 5U/μL)、2μLDM，混匀。
[0033] (4)反应程序为94°C预变性5min;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 环35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0034] (5)电泳检测对PCR产物进行聚丙締酷胺凝胶电泳检测。
[0035] (6)纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子 粒数的百分率表示。
[0036] 具有本品种特异带型的种子粒数为95,按公式：
玉米品种丹玉39号样品A纯度为=95/100=95%。
【主权项】
1. 一种玉米品种丹玉39号纯度检测的SSR分子标记试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 含有2对双亲互补特异性高、重复性好、结果稳定的SSR引物：SEQIDNO:1和2和SEQID NO:3 和 4 ; SEQIDNO:1序列（5, 一3'）GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG ; SEQIDNO:2 序列（5, 一 3'）CACGTACGGCAATGCAGACAAG; SEQIDNO:3 序列（5, - 3'）CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG ; SEQ IDNO:4序列（5, -3'）CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTG。2. 根据权利要求1所述的一种玉米品种丹玉39号纯度检测的SSR分子标记试剂盒，其 特征在于，以玉米品种丹玉39号的基因组DNA为模板，以SEQIDNO:1和2或SEQIDNO: 3和4为SSR特异性引物，进行PCR扩增。3.根据权利要求1所述的一种玉米品种丹玉39号纯度检测的SSR分子标记试剂盒，其 特征在于，PCR反应体系总体积20 μ L，包括14. 1 μ L超纯水、2 μ L 10倍PCR缓冲液、1. 2 μ L dNTPs(2.5mmol/L)、0. 5 yL SSR引物（0·25 μπιο1/υ、0· 2 yLDNA聚合酶（2.5U/yL)、 2yLDNA，混匀。4. 根据权利要求1所述的一种玉米品种丹玉39号纯度检测的SSR分子标记试剂盒，其 特征在于，反应程序为94°C预变性5min;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循环 35 次；72°C延伸 5min;4°C保存。5. 根据权利要求1所述的一种玉米品种丹玉39号纯度检测的SSR分子标记试剂盒，其 特征在于，纯度结果通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒 数的百分率表示。
【专利摘要】一种玉米品种丹玉39号纯度检测的SSR分子标记试剂盒，涉及一种分子标记检测试剂盒本发明利用父母本双亲互补特异性SSR引物对玉米品种丹玉39号进行纯度检测。以玉米品种丹玉39号及父母本双亲的基因组DNA为模板，通过对覆盖全基因组200对SSR引物进行筛选，获得两对双亲互补特异性高、重复性好、结果稳定的SSR引物，由其两对特异性引物和<i>Taq</i>酶等试剂开发出针对玉米品种丹玉39号纯度检测的试剂盒。该试剂盒的开发，不仅可以快速评价玉米纯度质量，为品种管理和市场监管提供技术支撑，还对提高种子产业整体质量水平，保证粮食种植安全具有一定的指导意义。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105256000
【申请号】CN201510449853
【发明人】岳静, 朱志成, 杨双
【申请人】沈阳化工大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年7月28日