一种利用qRT-PCR鉴定啤酒大麦Gairdner品种纯度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用qRT-PCR鉴定啤酒大麦Gairdner品种纯度的方法，属于制麦 和啤酒酿造领域。
【背景技术】
[0002] 啤酒大麦是是啤酒生产的主要原料，其品质优劣是决定啤酒质量的关键。啤酒大 麦品种不同，大麦籽粒的饱满度和粗蛋白含量及麦芽的品质如水分、浸出物、色度、总蛋白 及可溶性氮含量等指标也有所差异，最终也影响着成品啤酒的泡持性、浊度、成熟度和风味 等质量指标。除了遗传特性之外，啤酒大麦的酿造品质也受环境因素和农艺措施的影响，对 于某些品质性状，环境因子起着更大的决定作用。我国大麦主要产区相对集中，主要分布在 长江流域、黄河流域和青藏高原，按酿造性能可将啤酒大麦产区分为三类：甘肃新疆产区， 东北产区和江浙产区。啤酒工业的发展促进了对大麦原料的需求，其中西北和黑龙江等地 啤酒大麦发展较快。20世纪90年代，我国啤酒行业主要使用进口啤酒大麦，随着国际市场 的不稳定和价格上升，进入21世纪后，啤酒企业逐渐重视和使用国产啤酒大麦。尽管国内 大麦产量不断上升，但农艺性状优良、适宜于酿造的啤酒大麦品系缺乏，在质量上仍存在大 麦质量指标极差大、波动大、对应麦芽脆度低、微粉浸出物低，品质均一"性差等质量缺陷，大 部分只能做饲料用，而能用于啤酒行业的啤酒大麦只有150万吨左右。因此，每年需从澳大 利亚、加拿大、法国等欧洲国家进口啤酒大麦，以满足国内啤酒行业发展的需要。
[0003] 由于进口大麦品质优售价高，因而市场上常出现将混级大麦或国产质量稍好的大 麦混入进口一级大麦等以次充好的情况，这不仅造成了对外贸易或采购的经济损失，更影 响了以此为原料酿造的啤酒的品质，对生产周期、生产设备也可能造成一定影响，影响啤酒 行业的经济效益。进口大麦的品种和质量直接关系到麦芽的制作和啤酒酿造的工艺，这就 要求检验检疫部门能够准确地对进口大麦的品种和品种纯度进行鉴定。同时由于进口啤酒 大麦成本高，国产啤酒大麦质量日益完善，加上相关部门对其品种鉴定手段还不完善，使得 进口啤酒大麦在品种真实性问题上还存在一些挑战。因此，有必要对进口啤酒大麦进行品 种纯度及真实性鉴定。
[0004] 目前用于大麦品种鉴定的方法有感官评价法、物理化学法、DNA分子标记法、同工 酶电泳法等，但这些鉴定方法只能对品种进行判断，无法鉴定大麦样品的纯度，此外在品种 判断上也存在不确定性、假阳性或成本高、操作难度大等缺点。普遍被认可的方法是醇溶 蛋白SDS-PAGE电泳法，此方法可同时判断大麦样品的品种和纯度，具有较高的准确性，然 而，由于该方法需对大麦样品进行四分法取样，将取样得到的每一粒大麦种子的醇溶蛋白 进行提取及SDS-PAGE电泳、染色、脱色及与标准图谱的比较后，才能判断其品种及纯度，工 作量大，耗时长，因此存在一定的局限性。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术鉴 定啤酒大麦Gairdner品种纯度的方法。本发明利用啤酒大麦Gairdner品种标志蛋白BMAI-1(由基因IMAI-1编码），通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术建立其相对表达量与 其纯度的相关性曲线，并拟合线性方程，通过该相关性曲线检测未知纯度Gairdner大麦样 品的纯度。本发明方法检测的未知Gairdner大麦样品的纯度与传统SDS-PAGE方法检测的 纯度相差无几，检测时间明显缩短，工作量大大降低。同时，本发明适用于其它啤酒大麦品 种的纯度鉴定。
[0006] 所述方法是针对Gairdner的品种标志蛋白，利用qRT-PCR技术建立该标志蛋白相 对表达量与Gairdner品种纯度的相关性曲线，从而对Gairdner大麦样品纯度进行定量检 测。
[0007] 所述Gairdner的品种标志蛋白为由基因IMAI-1编码的α-淀粉酶抑制剂 ΒΜΑΙ-1〇
[0008] 所述qRT-PCR的引物为：标志蛋白编码基因IMAI-1特异引物如SEQIDN0:1和 SEQIDN0:2所示，内参基因为ACTIN。
[0009] 所述内参基因的特异引物如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示。
[0010] 所述相关性曲线为y= 〇. 〇129x-〇. 2748(R2= 0. 972)，其中y为样品中标志蛋白 编码基因IMAI-1相对于纯Gairdner大麦的IMAI-1基因的相对表达量，X为Gairdner大 麦样品纯度。
[0011] 所述方法是对未知Gairdner大麦样品进行qRT-PCR反应，通过标志蛋白的相对表 达量和相关性曲线，计算未知样品中Gairdner大麦的纯度。
[0012] 所述方法是：（1)人工制备不同纯度Gairdner啤酒大麦样品；（2)提取不同纯度 Gairdner啤酒大麦样品的总RNA;(3)根据标志蛋白编码基因IMAI-1设计如SEQIDN0:1 和SEQIDN0:2所示的特异引物，以肌动蛋白actin编码基因ACTIN为内参基因，分别进行 qRT-PCR，获得标志蛋白基因及内参基因的Ct值，以2 & ^表示标志蛋白基因的相对表达 倍数；(4)以样品纯度为横坐标，以标志蛋白基因相对表达量即2 为纵坐标，绘制标志 蛋白基因相对表达量与大麦样品纯度的拟合线性方程；(5)对任一未知大麦样品，提取总RNA，然后使用步骤3的方法进行qRT-PCR得到未知样品中标志蛋白基因相对表达量y，将y 代入拟合线性方程，即得未知样品中Gairdner大麦的纯度X。
[0013] 所述方法，具体由以下步骤组成：
[0014] (1)收集目前普遍采用的啤酒大麦样品（包括含Gairdner在内的6种澳大利亚啤 酒大麦及4种国产啤酒大麦），根据溶解性差别，分别进行分级提取种子醇溶蛋白，经过双 向电泳分离，利用图像分析软件找到各品种的共同蛋白和差异蛋白，并对共同蛋白和差异 蛋白进行质谱鉴定，不存在于共同蛋白中的差异蛋白即为Gairdner的特征蛋白或标志蛋 白。
[0015] (2)通过人工混种，获得一系列纯度梯度（60% -100% )的Gairdner大麦样品，分 别提取总RNA，根据其标志蛋白编码基因设计特异引物，以肌动蛋白actin编码基因ACTIN为内参基因，分别进行qRT-PCR，获得标志蛋白基因及内参基因的Ct值（每个反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的循环数），以2 表示标志蛋白基因的相对表达倍数 (ACt=Ct(标志蛋白基因)_Ct(ACTIN)，ΔACt=ACt(某一纯度)-ACt_%纯度)），以样品纯度为横坐标， 以标志蛋白基因相对表达量即2 纵坐标，绘制标志蛋白基因相对表达量与其纯度的 相关性曲线，并拟合线性方程。
[0016] (3)按步骤（2)的方法，分别提取纯度为100 %的标准Gairdner样品及待测 Gairdner大麦样品的mRNA，并进行qRT-PCR，根据Ct值计算2Λ&(^并代入标志蛋白基因相 对表达量与其纯度的相关性曲线方程，即可计算出待测样品的纯度。
[0017] 本发明的有益效果：本发明方法与目前认可的SDS-PAGE方法具有相同的准确率， 但在操作上更简便快捷、检测时间明显缩短、工作量大大降低。利用本发明检测啤酒大麦样 品纯度，具有良好的应用前景。同时，本发明适用于其它啤酒大麦品种的纯度鉴定。
【附图说明】
[0018] 图1为啤酒大麦醇溶蛋白分级提取流程；
[0019] 图2为大麦醇溶蛋白的双向电泳图谱，a.Gairdner;b.Baudin;
[0020] 图3为大麦醇溶蛋白的双向电泳图谱，c.Hindmarsh;d.Vlamingh;e.Commander； f.Schooner；
[0021] 图4为大麦醇溶蛋白的双向电泳图谱，g.苏啤3号；h.苏啤6号；i垦啤7号；j 星啤10号；
[0022] 图5为标志蛋白相对表达量与Gairdner纯度的相关性曲线；
[0023] 图6为三个未知Gairdner样品a,b，c各籽粒醇溶蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例1~实施例3所涉及实