一种快速检测鸡伤寒沙门氏菌的pcr-hrm引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病原微生物的诊断及检测技术领域，特别涉及一种快速检测鸡伤寒沙 门氏菌的PCR-HRM引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌（Salmonella)是一种最常见的人兽共患病原菌，有2500种以上血清型， 其宿主范围广，能广泛存活于人类、温血和冷血动物体内以及食品和外界环境中，对人和许 多动物有致病性，在我国细菌性食物中毒中70 %~80 %是由沙门菌引起，90 %为肉类等动 物性食品。鸡伤寒沙门氏菌（Salmonellagallinarum)是沙门氏菌的一种血清型，其能引 起的家禽败血性传染病，病鸡可迅速死亡，主要侵害3月龄以上的家禽，主要发生于鸡，也 可感染火鸡与鸭。其症状与鸡白痢相似。所以在兽医临床中鉴别诊断这两种病极其重要。
[0003] 传统的诊断方法是利用血清学诊断，但是其与鸡白痢沙门氏菌具有很高的交叉凝 集反应性。DevendraH(2005年）利用鸡白痢沙门氏菌及禽伤寒沙门氏菌rfbS基因规律性 变化设计特异性的引物，建立等位基因特异性PCR方法，与传统方法比检测效率提高。徐耀 辉等（2005年）根据鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌fliC基因可变区两端的保守序列 设计1对引物，PCR扩增出约600bp的产物，用Hin6I对PCR产物进行酶切，经RFLP分析区 分鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌的生物型。鉴定结果与生化特性符合，并且灵敏度高。 但是这些方法都检测时间长，并且需要经过酶切、电泳等程序来判定结果，在养殖长沙门氏 菌净化中效率过低。
[0004] 高分辨率恪解曲线（HRM，high-resolutionmelting)是根据核酸的特性，无需使 用序列特异性探针，利用一种饱和染料，对PCR反应产物进行基因分析的一种技术。可以采 用非标记的探针对已知位点的SNP或突变进行基因分型研究。采用非标记探针法对已知位 点的基因分型研究具有廉价、快速、简便等特点，因此被大量应用在疾病、及病原菌检测方 面。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种快速检测鸡伤 寒沙门氏菌的PCR-HRM引物。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种快速检测鸡伤寒沙门氏菌的PCR-HRM方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供所述快速检测鸡伤寒沙门氏菌的PCR-HRM引物的应 用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] 一种快速检测鸡伤寒沙门氏菌的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下：
[0010] 上游引物Sg-up:5^ -TGTTAATAATTTCCCCAA-3'或其核苷酸的互补序列；
[0011] 下游引物Sg-lowW-AGTCTCTACATATTCACG-3'或其核苷酸的互补序列。
[0012] 所述的Sg-up和Sg-low是根据Genbenk上已发表的鸡伤寒沙门氏菌rfbS基因序 列，在598位碱基两侧设计的引物。扩增片段大小为79bp。
[0013] 一种快速检测鸡伤寒沙门氏菌的PCR-HRM方法，包括以下步骤：
[0014]A:提取细菌DNA;
[0015] B :以DNA为模板，利用上述所述的上游引物Sg-up、下游引物Sg-low和饱和焚光 染料进行扩增反应，获得扩增产物；
[0016]C:对扩增产物进行HRM分析，确定是否为鸡伤寒沙门氏菌。
[0017] 进一步的，步骤B所述的PCR扩增反应体系为：
[0018]
[0019] 所述的饱和焚光染料优选为Eva green染料。
[0020] 所述的引物rfbS-F和引物rfbS-R的浓度各优选为lOnmol/μL;
[0021] 进一步的，步骤Β所述的扩增反应程序为：
[0024] 进一步的，步骤C所述的HRM分析的具体分析过程为：以鸡伤寒沙门氏菌标准阳性 模板扩增后的熔解温度Tm值为参考，待测样品熔解温度Tm值置信值（GCP)大于95%为鸡 伤寒沙门氏菌。
[0025] 所述的快速检测鸡伤寒沙门氏菌的PCR-HRM引物可应用于鸡伤寒沙门氏菌的检 测，养殖场鸡伤寒沙门氏菌的净化，分子流行病学调查以及家禽养殖中鸡伤寒沙门氏菌的 风险评估。
[0026] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0027] (1)本发明针对鸡伤寒沙门氏菌在rfbS基因上598位点上的规律性变化设计 PCR-HRM引物，与饱和荧光染料结合能力强，熔解曲线分辨率高。高分辨熔解曲线检测无需 特异性的探针，无需测序，使用简便，并且检验过程中不消耗PCR产物，可以进一步进行下 游分析。
[0028] (2)本发明首次建立了一种快速检测鸡伤寒沙门氏菌的PCR-HRM引物并应用，其 操作方便，检测时只需要在PCR反应中加入饱和荧光染料；简化了临床检验的流程并且大 大缩短了检测时间，与传统国标鉴定方法相比时间节省了 2/3 ;并且该方法具有高通量、低 成本的特点，一次最多可以检验384个样本。与传统PCR后电泳开放操作相比，本发明从 PCR过程到HRM分析实现了真正的闭管操作，整个过程PCR产物无需再转入其他装置，避免 了交叉污染，并且可以完成定量分析。
[0029] (3)本发明特异性强，能够很好的从肠炎沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌以及其他细 菌中区分鸡伤寒沙门氏菌，解决了传统检测方法鉴别鸡伤寒沙门氏菌准确率低的问题。本 发明灵敏度高，最低检测下限能达到42个拷贝数每微升（μL)。在鸡伤寒沙门氏菌的快速 诊断中展示了广阔的应用前景。
【附图说明】
[0030] 图1是鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌与标准样品HRM标准化 熔解曲线图。
[0031] 图2是鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌与其他细菌标准样品 HRM峰型化熔解曲线图。
[0032]图3是鸡伤寒沙门氏菌灵敏度检测峰型化熔解曲线图。
[0033]图4是鸡伤寒沙门氏菌临床样品检测峰型化熔解曲线图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0035] 实施例1用于检测鸡伤寒沙门氏菌HRM引物与反应条件
[0036] (1)引物：根据NCBI已公布的沙门氏菌全基因组序列以及查阅相关资料发现鸡 伤寒沙门氏菌在rfbS基因上598位有规律性的变化，所有鸡伤寒都为Α，而鸡白痢、肠炎 等血清型为G，别的一些血清型和别的种类的菌株不含有该基因或者变化较大，固可根据 此位点设计特异扩增引物。采用01ig〇7引物设计软件，根据GeneBank发布的沙门氏菌 rfbS序列（鸡白痢沙门氏菌的rfbS序列的GeneBank登录号：LK931482 ;鸡伤寒沙门氏菌 的rfbS序列的GeneBank登录号：AF442573 ;肠炎沙门氏菌rfbS序列的GeneBank登录号： CP007267)以及鸡伤寒沙门氏菌标准菌株测序获得的rfbS序列（该rfbS序列与GeneBank 登录号：AF442573中的相同），在rfbS基因598位点两侧设计引物对。上游引物Sg-up: 5' -TGTTAATAATTTCCCCAA-3';下游引物Sg-low:5' -AGTCTCTACATATTCACG-3'。扩增的 片段为79bp。
[0037] (2)反应条件：根据引物确定反应体系和反应程序：
[0038]PCR-HRM反应体系为 10μL:
[0039]
[0040]PCR-HRM反应程序为：
[0041]
[0042] 实施例2用于检测鸡伤寒沙门氏菌的PCR-HRM引物的应用方法
[0043](一）鸡伤寒沙门氏菌标准品的制备及PCR-HRM分析
[0044] (1)细菌DNA的提取：
[0045] 复苏鸡伤寒沙门氏菌标准菌株（CICC