分泌表达glp-1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法及应用
【专利摘要】一种分泌表达GLP?1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法及应用，是通过化学合成人源胰高血糖素样肽I基因，简称GLP?1，即1?37个氨基酸的有效功能区域，并加入真核细胞特有的分泌表达穿膜肽基因,构建pLive?GLP?1重组质粒，电转进入减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，实现GLP?1的分泌表达，并通过口服或静脉注射进入人体血液循环后可以实现GLP?1的持续表达，实现对II型糖尿病病症的缓解和治疗作用。
【专利说明】
分泌表达GLP-1的减毒鼠伤寒沙口氏菌的制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种分泌表达膜高血糖素样肤I的减毒鼠伤寒沙口氏菌在治疗II型糖 尿病中的应用，通过构建化ive-化P-I表达载体，在添加真核细胞穿膜肤后，采用电转的方 法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009，利用减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009穿梭 细胞的特性，实现化P-I在细胞中的分泌表达，并通过静脉注射等方式实现人体内表达，达 到缓解和治疗II型糖尿病的作用
【背景技术】
[0002] 膜高血糖素样肤I，简称化P-I，由膜高血糖素原基因表达，肠粘膜L细胞、膜岛a细 胞、及神经元均有该基因存在，其中肠道细胞和神经元中膜高血糖素原基因的表达产物是 GLP-IdGLP-I有两种生物活性形式，分别为GLP-I (7-37)和GLP-I (7-36)酷胺，GLP-I约80% 的循环活性来自GLP-I (7-36)酷胺。
[0003] GLP-I作为一种肠促膜素，由肠道L细胞分泌，具有葡萄糖依赖的膜岛素促泌作用、 抑制膜高血糖素分泌、刺激e细胞增殖分化和抑制e细胞调亡、抑制食欲及摄食、延缓胃排 空，能恢复II型糖尿病患者受损的"肠促膜素效应"，是一类新型的糖尿病治疗药物。但是， GLP-I在人体血液中极易被二肤氨肤酶IV降解，简称DPP IV，仅在血液中存在2分钟左右，所 W在医学上多采用GLP-I类似物或者DPP IV抑制剂来延长GLP-I的生理作用时间。
[0004] 与此同时，减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009属于敲除其毒理基因的改造菌株，由于 该改造菌株毒性小，且均有良好的穿梭细胞的特性，现今已有多种利用减毒鼠伤寒沙口氏 菌VNP20009表达的药物进入1期、2期、3期临床实验，安全性可靠。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种分泌表达膜高血糖素样肤I的减毒鼠伤寒沙口氏菌的 制备方法及其在治疗11型糖尿病中的应用，建立了一种GLP-I减速鼠伤寒沙口氏菌 VMNP20009表达系统，通过该菌穿梭细胞的特性实现细胞内化P-I的表达，发挥化P-I间接降 血糖的功能，从而实现对II型糖尿病的缓解和治疗作用；
[0006] 本发明所述制备方法包括下列步骤：
[0007] -、pLive-GLP-1 重组质粒构建
[000引1、通过生物信息学分析，选择化P-I氨基酸序列1-37,同时设计在化P-I前面加一 穿膜肤，序列N端和C端加NheI和BamHI两个酶切位点。之后将设计好的序列交测序公司合 成，得到pU巧7-GLP-1重组质粒；
[0009] 2、构建 pLive-GLP-1 重组质粒
[0010] A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pLive，pUC57-GLP-l质粒；
[0011] B酶切
[0012] pLive，pUC57-GLP-l酶切体系如下，总体系为25化，37°C酶切4h;
[0013]
[0014] C配制2%琼脂糖凝胶电泳；IlOV电压下电泳45min，在片段168bp和载体3400bp切 胶回收；
[0015] D酶连
[0016] 体系如下，总体系IOuLJragment: Vector = S: 1和10:1，10°C过夜；
[0017]
[001引 E转化
[0019] a从-8(TC冰箱中取200化Top 10感受态细胞悬液，冰上解冻；
[0020] b加入化L质粒溶液，质粒浓度不低于2(K)ngAiL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；
[0021] c42°C水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min;
[0022] d向管中加入80化L LB液体培养基，混匀后37°C振荡培养化，使细菌恢复正常生长 状态。离屯、4000巧m，Imin。弃上清80化L，留20化L菌液，混匀；
[0023] e将上述菌液摇匀后取20化L涂布于含SOngAiL Kan的筛选平板上，正面向上放置 半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养16-2地，挑取单克隆；
[0024] F送公司测序；
[00巧]G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒化ive-GLP-1，保存备用， 步骤同步骤一；
[0026] 二、pLive-GLP-1电转减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009
[0027] A减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009感受态制备
[002引 a取-80°C冻存的减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009接种于5血LB液体培养基中，37°C 过夜培养；
[0029] b将获得菌液按照1 %接种于LB液体培养基中，37°C静置培养至菌体ODso日值为0.3- 0.4，收集备用；
[0030] C将W上收集的菌体培养物冰浴IOmin，4°C离屯、5000巧m/min，5min;收集菌体；
[0031] d沉淀用冰冷的10 %甘油溶液1/10体积清洗两次，4 °C离屯、8000巧m/min，5min，收 集沉淀。
[0032] e最后沉淀重悬于1/100体积10%甘油溶液中，冰浴IOmin后即可使用。
[0033] B减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009电转化
[0034] a取化L重组质粒，浓度不低于ISOngAiL,与上述方法制备的50化冰冷的减毒鼠伤 寒沙口氏菌VNP20009感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1 cm电击杯中，置于冰 上静置5min，设置条件为1800V，200Q，2^F;
[0035] b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离屯、管中，同时计入8(K)化的LB液体 培养基中，37°C培养1.化，取I(K)化转化后产物涂布在含有SOngAiL Kan抗性的LB平板上，37 °(：静置培养12h，筛选阳性克隆子；
[0036] =、减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009与人源胚胎肾细胞293-T细胞共培养
[0037] A将293-T细胞按照50000个/孔接种到24孔板中，第二天备用；
[0038] B将重组减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009复苏，过夜培养；
[0039] C当VNP2009长至10化FU/mL，采用等体积不含双抗的含有10%胎牛血清的DMEM培 养基洗涂细菌3次，按照细菌:细胞200:1接种24孔板，处理6-化;更换含双抗的含有10 %胎 牛血清的DMEM培养基，处理36h;
[0040] D收集细胞培养的上清和沉淀进行蛋白检测；
[0041 ] 四、Western检测pLive-GLP-1在293-T细胞中的分泌表达
[0042] A 电泳
[0043] a 配制12 % SDS-PAGE 凝胶
[0044] b样品处理
[0045] 将上述收集的蛋白样品中加入浓度4 X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，终浓度为1 X， 100°C或沸水浴加热3-5分钟，W充分变性蛋白。
[0046] C上样与电泳
[0047] 冷却到室溫后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液可W 使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液;1OOV电泳90~120min;
[004引 B Western检测
[0049] a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜;条件为80V 45min;
[0050] b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涂液中，漂洗1-2分 钟，W洗去膜上的转膜液；
[0051] C加入Western封闭液，即5%脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室溫封闭90分钟；
[0052] d兔源化P-I多克隆抗体按照1:1000采用5%脱脂牛奶稀释;将蛋白膜转移至含一 抗的5 %脱脂牛奶中4°C在侧摆摇床上缓慢摇动解育过夜，TBST洗涂S次，每次IOmin;
[0053] e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5%脱脂牛奶稀释;将蛋白膜 转移至含二抗的5 %脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动解育60min，TBST洗涂S次，每次 IOmin；
[0化4] f显色液A液和B液各25化L 1:1避光混合，现配现用，曝光。
[0055] 本发明所述分泌表达膜高血糖素样肤I的减毒鼠伤寒沙口氏菌的应用为：
[0056] -、链脈佐菌素诱导二型糖尿病小鼠模型的建立
[0化7] SPF级小鼠随机分为正常对照组10只和模型组10只。正常对照组小鼠饲喂普通饲 料4周后，小鼠腹腔注射STZ溶剂(巧樣酸缓冲液，即0.1 M巧樣酸钢:0.1 M巧樣酸为1:1.32，pH = 4.5)，饲喂普通饲料3周;模型组小鼠饲喂高脂高糖饲料4周后，腹腔一次性注射lOOmg/kg 的STZ，继续饲喂高脂高糖饲料3周。小鼠II型糖尿病成模标准：空腹血糖> 11. Immo 1/L，且 有多饮、多尿、多食、体重增加不明显，即为造模成功。
[005引二、减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009灌胃
[0059] 将造模成功后的小鼠，灌胃重组减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009,菌液经生理盐水 洗涂2次后，隔天灌胃一次，标准为5 X IO6CFUAg，共进行5次;正常组饲喂普通饲料，造模组 饲喂局脂局糖饲料；
[0060] S、组织样品收集
[0061] 正常对照组和造模组分别在尾静脉注射后第屯天，取小鼠血液、肠组织和肝组织， 组织破碎后检测是否表达GLP-I;并检测小鼠血糖含量和膜岛素含量是否与正常组一致。
[0062] 本发明的有益效果:本发明通过构建pLive-GLP-1表达载体，在添加真核细胞穿膜 肤后，采用电转的方法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009，利用减毒鼠伤寒沙 口氏菌VNP20009穿梭细胞的特性，实现GLP-I在细胞中的分泌表达，并通过静脉注射等方式 实现人体内表达，达到缓解和治疗II型糖尿病的作用。
【具体实施方式】
[0063] 本发明所述制备方法包括下列步骤：
[0064] -、pLive-GLP-1 重组质粒构建
[0065] 1、通过生物信息学分析，选择化P-I氨基酸序列1-37,同时设计在化P-I前面加一 穿膜肤，序列N端和C端加NheI和BamHI两个酶切位点。之后将设计好的序列交测序公司合 成，得到pU巧7-GLP-1重组质粒；
[0066] 2、构建 pLive-GLP-1 重组质粒
[0067] A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pLive，pUC57-GLP-l质粒；
[006引 B酶切
[0069] pLive，pUC57-GLP-l酶切体系如下，总体系为25化，37°C酶切4h;
[00701
[0071] C配制2%琼脂糖凝胶电泳；Iiov电压下电泳45min，在片段168bp和载体3400bp切 胶回收；
[0072] D 酶连
[0073] 体系如下，总体系IOuLJragment: Vector = S: 1和10:1，10°C过夜；
[0074]
[0075] E 转化
[0076] a从-80°C冰箱中取20化L Top 10感受态细胞悬液，冰上解冻；
[0077] b加入化L质粒溶液，质粒浓度不低于20化g/jiL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；
[0078] c42°C水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min;
[00巧]d向管中加入80化L LB液体培养基，混匀后37°C振荡培养化，使细菌恢复正常生长 状态。离屯、4000巧m，Imin。弃上清80化L，留20化L菌液，混匀；
[0080] e将上述菌液摇匀后取20化L涂布于含SOngAiL Kan的筛选平板上，正面向上放置 半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养16-2地，挑取单克隆；
[0081] F送公司测序；
[0082] G测序成功后，义用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒化ive-GLP-1，保存备用， 步骤同步骤一；
[0083] 二、pLive-GLP-1电转减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009
[0084] A减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009感受态制备
[0085] a取-80°C冻存的减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009接种于5血LB液体培养基中，37°C 过夜培养；
[0086] b将获得菌液按照1 %接种于LB液体培养基中，37°C静置培养至菌体ODso日值为0.3- 0.4，收集备用；
[0087] C将W上收集的菌体培养物冰浴IOmin，4°C离屯、5000巧m/min，5min;收集菌体；
[008引 d沉淀用冰冷的10 %甘油溶液1/10体积清洗两次，4 °C离屯、8000巧m/min，5min，收 集沉淀。
[0089] e最后沉淀重悬于1/100体积10%甘油溶液中，冰浴IOmin后即可使用。
[0090] B减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009电转化
[0091] a取化L重组质粒，浓度不低于150ng/化，与上述方法制备的50化冰冷的减毒鼠伤 寒沙口氏菌VNP20009感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1 cm电击杯中，置于冰 上静置5min，设置条件为1800V，200Q，2^F;
[0092] b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离屯、管中，同时计入80化L的LB液体 培养基中，37°C培养1.化，取I(K)化转化后产物涂布在含有SOngAiL Kan抗性的LB平板上，37 °(：静置培养12h，筛选阳性克隆子；
[0093] =、减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009与人源胚胎肾细胞293-T细胞共培养
[0094] A将293-T细胞按照50000个/孔接种到24孔板中，第二天备用；
[00M] B将重组减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009复苏，过夜培养；
[0096] C当VNP2009长至10化FU/mL，采用等体积不含双抗的含有10%胎牛血清的DMEM培 养基洗涂细菌3次，按照细菌:细胞200:1接种24孔板，处理6-化;更换含双抗的含有10 %胎 牛血清的DMEM培养基，处理36h;
[0097] D收集细胞培养的上清和沉淀进行蛋白检测；
[0098] 四、Western检测pLive-GLP-1在293-T细胞中的分泌表达
[0099] A 电泳
[0100] a 配制12 % SDS-PAGE 凝胶
[0101] b样品处理
[0102] 将上述收集的蛋白样品中加入浓度4XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液，终浓度为IX， 100°C或沸水浴加热3-5分钟，W充分变性蛋白。
[0103] C上样与电泳
[0104] 冷却到室溫后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液可W 使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液;1OOV电泳90~120min;
[01 化]B Western检测
[0106] a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜;条件为80V 45min;
[0107] b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涂液中，漂洗1-2分 钟，W洗去膜上的转膜液；
[0108] C加入Western封闭液，即5%脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室溫封闭90分钟；
[0109] d兔源化P-I多克隆抗体按照1:1000采用5%脱脂牛奶稀释;将蛋白膜转移至含一 抗的5 %脱脂牛奶中4°C在侧摆摇床上缓慢摇动解育过夜，TBST洗涂S次，每次IOmin;
[0110] e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5%脱脂牛奶稀释;将蛋白膜 转移至含二抗的5 %脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动解育60min，TBST洗涂S次，每次 IOmin；
[0111] f显色液A液和B液各25化L 1:1避光混合，现配现用，曝光。
[0112] 本发明所述分泌表达膜高血糖素样肤I的减毒鼠伤寒沙口氏菌的应用为：
[0113] -、链脈佐菌素诱导二型糖尿病小鼠模型的建立
[0114] SPF级小鼠随机分为正常对照组10只和模型组10只。正常对照组小鼠饲喂普通饲 料4周后，小鼠腹腔注射STZ溶剂(巧樣酸缓冲液，即0.1 M巧樣酸钢:0.1 M巧樣酸为1:1.32，pH = 4.5)，饲喂普通饲料3周;模型组小鼠饲喂高脂高糖饲料4周后，腹腔一次性注射lOOmg/kg 的STZ，继续饲喂高脂高糖饲料3周。小鼠II型糖尿病成模标准：空腹血糖> 11. Immo 1/L，且 有多饮、多尿、多食、体重增加不明显，即为造模成功。
[0115] 二、减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009灌胃
[0116] 将造模成功后的小鼠，灌胃重组减毒鼠伤寒沙口氏菌VNP20009,菌液经生理盐水 洗涂2次后，隔天灌胃一次，标准为5 X IO6CFUAg，共进行5次;正常组饲喂普通饲料，造模组 饲喂局脂局糖饲料；
[0117] S、组织样品收集
[0118] 正常对照组和造模组分别在尾静脉注射后第屯天，取小鼠血液、肠组织和肝组织， 组织破碎后检测是否表达GLP-I;并检测小鼠血糖含量和膜岛素含量是否与正常组一致。
【主权项】
1. 一种分泌表达GLP-1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的制备方法，其特征在于： 一、pLive_GLP_l重组质粒构建 a) 通过生物信息学分析，选择GLP-1氨基酸序列1-37,同时设计在GLP-1前面加一穿膜 肽，序列N端和C端加 Nhel和BamHI两个酶切位点。之后将设计好的序列交测序公司合成，得 到pUC57-GLP-l重组质粒； b) 构建pLive-GLP-Ι重组质粒 A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pLive，pUC57-GLP-l质粒； B酶切 pLi ve，pUC57-GLP-l酶切体系如下，总体系为25yL，37 °C酶切4h;〇配制2%琼脂糖凝胶电泳；110￥电压下电泳451]1；[11，在片段168&口和载体340(^口切胶回 收； D酶连 体系如下，总体系10此，？抑81116111::￥6(31：(^ = 5:1和10:1，10°(^过夜；E转化 a从-80°C冰箱中取200yL Top 10感受态细胞悬液，冰上解冻； b加入2yL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/yL，轻轻摇匀，冰上放置30min后； c42°C水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min; d向管中加入800yL LB液体培养基，混匀后37°C振荡培养lh，使细菌恢复正常生长状 态。离心4000rpm，lmin;弃上清800yL，留200yL菌液，混勾； e将上述菌液摇匀后取200yL涂布于含50ng/yL Kan的筛选平板上，正面向上放置半小 时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37 °C培养16-24h，挑取单克隆； F送公司测序； G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pLive-GLP-Ι，保存备用，步骤 同步骤一； 二、 pLive-GLP-Ι电转减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009 A减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009感受态制备 a取-80°C冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009接种于5mL LB液体培养基中，37°C过夜 培养； b将获得菌液按照1 %接种于LB液体培养基中，37 °C静置培养至菌体OD600值为0.3-0.4， 收集备用； c将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4°C离心5000rpm/min，5min;收集菌体； d沉淀用冰冷的10 %甘油溶液1 /10体积清洗两次，4 °C离心8000rpm/min，5min，收集沉 淀； e最后沉淀重悬于1/100体积10%甘油溶液中，冰浴lOmin后使用； B减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009电转化 a取2yL重组质粒，浓度不低于150ng/yL，与上述方法制备的50yL冰冷的减毒鼠伤寒沙 门氏菌VNP20009感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静 置5min，设置条件为 1800ν，200Ω，25yF; b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到尚心管中，同时计入800yL的LB液体培养 基中，37°C培养1.5h，取100yL转化后产物涂布在含有50ng/yL Kan抗性的LB平板上，37°C静 置培养12h，筛选阳性克隆子； 三、 减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009与人源胚胎肾细胞293-T细胞共培养 A将293-T细胞按照50000个/孔接种到24孔板中，第二天备用； B将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009复苏，过夜培养； C当VNP2009长至108CFU/mL，采用等体积不含双抗的含有10%胎牛血清的01^1培养基洗 涤细菌3次，按照细菌:细胞200:1接种24孔板，处理6-8h;更换含双抗的含有10 %胎牛血清 的DMEM培养基，处理36h; D收集细胞培养的上清和沉淀进行蛋白检测； 四、 Western检测pLive-GLP-Ι在293-T细胞中的分泌表达 A电泳 a配制12 % SDS-PAGE凝胶 b样品处理 将上述收集的蛋白样品中加入浓度4 X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，终浓度为1 X，100°C 或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白； c上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；电泳时电泳液可以使用 碧云天生产的SDS-PAGE电泳液；100V电泳90~120min; B Western检测 a采用硝酸纤维素膜转膜，即NC膜;条件为80V 45min; b转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以 洗去膜上的转膜液； c加入Western封闭液，即5 %脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动，室温封闭90分钟； d兔源GLP-1多克隆抗体按照1:1000采用5%脱脂牛奶稀释;将蛋白膜转移至含一抗的 5 %脱脂牛奶中4°C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜，TBST洗涤三次，每次lOmin; e辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG按照1:1000采用5%脱脂牛奶稀释;将蛋白膜转移 至含二抗的5 %脱脂牛奶中，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min，TBST洗涤三次，每次lOmin; f显色液A液和B液各250yL 1:1避光混合，现配现用，曝光。2. -种分泌表达GLP-1的减毒鼠伤寒沙门氏菌的应用，其特征在于： 一、 链脲佐菌素诱导二型糖尿病小鼠模型的建立 SPF级小鼠随机分为正常对照组10只和模型组10只，正常对照组小鼠饲喂普通饲料4周 后，小鼠腹腔注射STZ溶剂，所述溶剂为柠檬酸缓冲液，即0.1M柠檬酸钠:0.1M柠檬酸为1: I. 32，pH = 4.5,饲喂普通饲料3周；模型组小鼠饲喂高脂高糖饲料4周后，腹腔一次性注射 100mg/kg的STZ，继续饲喂高脂高糖饲料3周，小鼠 II型糖尿病成模标准：空腹血糖多 II. lmmol/L，且有多饮、多尿、多食、体重增加不明显，即为造模成功； 二、 减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009灌胃 将造模成功后的小鼠，灌胃重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009,菌液经生理盐水洗涤2 次后，隔天灌胃一次，标准为5X106CFU/kg，共进行5次；正常组饲喂普通饲料，造模组饲喂 尚脂尚糖伺料； 二、组织样品收集 正常对照组和造模组分别在尾静脉注射后第七天，取小鼠血液、肠组织和肝组织，组织 破碎后检测是否表达GLP-1;并检测小鼠血糖含量和胰岛素含量是否与正常组一致。
【文档编号】C12N15/62GK105925598SQ201610318452
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】辛洪波, 陈廷涛, 王鑫
【申请人】南昌大学